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    本發明係關於偶聯水溶性脂肪酸衍生物與治療蛋白質之材料及方法，其包括使治療蛋白質與活化之水溶性脂肪酸衍生物在允許偶聯之條件下接觸。
    公开号:TW201305090A
    申请号:TW100147675
    申请日:2011-12-21
    公开日:2013-02-01
    发明作者:Juergen Siekmann；Richard Scheinecker；Hanspeter Rottensteiner；Peter Turecek
    申请人:Baxter Int；Baxter Healthcare Sa；
    IPC主号:A61K47-00
    专利说明:
    用於偶聯水溶性脂肪酸衍生物與蛋白質之材料及方法
    本發明係關於用於偶聯水溶性脂肪酸衍生物與蛋白質之材料及方法。
    多種分子及/或化合物已描述用於偶聯於治療蛋白質以便增加所偶聯蛋白質在施用於患者後之半衰期(Veronese FM及Mero A,BioDrugs 2008;22:315-29；Gregoriadis G等人,Int J Pharm 2005;300:125-30；及Shechter Y等人；International Journal of Peptide Research and Therapeutics 2007;第13卷：105-17)。
    可將脂肪酸(FA)偶聯於治療蛋白質以形成長效衍生物。延長蛋白質或肽半衰期之此原理係基於FA可結合人類血清白蛋白(HSA；亦稱為白蛋白結合探針)之實情。FA與血流中人類血清白蛋白之締合可使治療蛋白質之半衰期獲得實質性延長，此係因為其將隨白蛋白一起經由新生兒Fc受體進行再循環。FA及其衍生物(例如相應甲酯)顯示類似的白蛋白結合性質(Spector AA,J Lipid Res 1975;16:165-79)。
    此長效原理之一個著名實例為來自Novo Nordisk之地特胰島素(insulin detemir)(Levemir)。在地特胰島素中，FA之羧基共價偶合於胰島素蛋白質之離胺酸之ε-胺基(參見例如US 5,866,538；US 6,011,007；及US 6,869,930)。其他研究組已描述了類似方法(Shechter Y等人,Bioconj Chem 2005;16:913-20；及Sasson K等人,J Control Release 2010;142:214-20)。舉例而言，該等研究組描述含有活性NHS酯以供與蛋白質之胺基偶合的可釋放FMOC系統。然而差異在於，在此構想中，FA經由ω-位上之官能基連接於蛋白質，由此使羧基保持完整。因此，可製備與人類血清白蛋白結合但隨時間解離之長效前藥，因為FMOC系統在生理條件下經歷緩慢水解(Sasson K等人,J Control Release 2010;142:214-20)。
    除脂肪酸外，亦可利用多種化學方法藉由在水溶性聚合物與治療蛋白質之間形成共價鍵來製備偶聯物。多肽藥物之聚乙二醇化在循環中對其進行保護並且改良其藥效學及藥物動力學特徵(Harris及Chess,Nat Rev Drug Discov. 2003;2:214-21)。聚乙二醇化過程將乙二醇之重複單元(聚乙二醇(PEG))連接至多肽藥物。PEG分子具有較大流體動力學體積(球狀蛋白質尺寸之5至10倍)，具有高度水溶性且水合、無毒、不具免疫原性且自身體快速清除。分子之聚乙二醇化可導致藥物對酶促降解之抗性增強、活體內半衰期增加、給藥頻率降低、免疫原性降低、物理及熱穩定性增強、溶解性增強、液體穩定性增強及聚集減少。第一個聚乙二醇化藥物由FDA在二十世紀九十年代早期批准。此後，FDA又批准若干種聚乙二醇化藥物用於經口、注射及局部外表施用。
    聚唾液酸(PSA)亦稱為聚乙醯神經胺酸(CA)，為天然產生之多醣。其為具有α(2→8)酮苷鍵之N-乙醯基神經胺酸之均聚物，且在其非還原末端含有鄰位二醇基。其帶負電荷且為人體之天然成分。其可容易地由細菌大量且以預定物理特徵產生(美國專利第5,846,951號)。因為細菌產生之PSA在化學上及在免疫學上與在人體中產生之PSA相同，因此細菌PSA不具免疫原性，甚至在偶合至蛋白質時亦是如此。不同於一些聚合物，PSA酸可生物降解。聚乙醯神經胺酸與過氧化氫酶(catalase)及天冬醯胺酶(asparaginase)之共價偶合已顯示增強在蛋白水解酶或血漿存在下之酶穩定性。與聚唾液酸化及未修飾天冬醯胺酶之活體內比較研究揭示，聚唾液酸化增加酶之半衰期(Fernandes及Gregoriadis,Int J Pharm. 2001;217:215-24)。
    PEG衍生物與肽或蛋白質之偶合由Roberts等人回顧(Adv Drug Deliv Rev 2002;54:459-76)。一種偶合水溶性聚合物與治療蛋白質之方法為經由蛋白質之碳水化合物部分偶聯聚合物。蛋白質中碳水化合物之鄰位羥基(OH)容易被過碘酸鈉(NaIO4)氧化形成活性醛基(Rothfus及Smith,J Biol Chem 1963;238:1402-10;van Lenten及Ashwell,J Biol Chem 1971;246:1889-94)。隨後可藉由使用含有例如活性醯肼基之試劑將聚合物偶合至碳水化合物之醛基(Wilchek M及Bayer EA,Methods Enzymol 1987;138:429-42)。最近之技術為使用含有胺氧基之試劑，胺氧基與醛反應形成肟鍵聯(WO 96/40662、WO2008/025856)。
    描述水溶性聚合物與治療蛋白質之偶聯的其他實例描述於以下文獻中：WO 06/071801，其教示氧化馮威勒布蘭德因子(von Willebrand factor)中之碳水化合物部分且隨後使用醯肼化學與PEG偶合；美國公開案第2009/0076237號，其教示氧化rFVIII且隨後使用醯肼化學與PEG及其他水溶性聚合物(例如PSA、HES、葡聚糖)偶合；WO 2008/025856，其教示氧化不同凝血因子(例如rFIX、FVIII及FVIIa)且隨後使用胺氧基化學藉由形成肟鍵聯與例如PEG偶合；及美國專利第5,621,039號，其教示氧化FIX且隨後使用醯肼化學與PEG偶合。
    儘管存在上述用於蛋白質偶聯之材料及方法，但仍需要例如允許操作及製備穩定蛋白質偶聯物之新穎材料及方法。雖然脂肪酸可提供結合HSA之益處，但脂肪酸通常在水性環境中難以操作且可能隨時間自其蛋白質結合搭配物釋放或移除。
    本發明提供用於偶聯聚合物及水溶性脂肪酸衍生物與蛋白質之材料及方法，此舉改良蛋白質之藥效學及/或藥物動力學性質，同時使與各種試劑相關之成本及患者受者之健康風險降至最低，其中偶聯反應由親核性催化劑催化。本發明提供用於在水溶液中偶聯水溶性脂肪酸衍生物與蛋白質之材料及方法，由此產生穩定的蛋白質偶聯物，其中脂肪酸衍生物不隨時間釋放。
    在本發明之一個實施例中，所提供之水溶性脂肪酸衍生物包含脂肪酸或脂肪酸酯連接於水溶性連接子，該脂肪酸衍生物穩定連接於治療蛋白質。在另一實施例中，脂肪酸衍生物在活體外或活體內結合人類血清白蛋白(HSA)。在另一實施例中，脂肪酸衍生物-治療蛋白質偶聯物相對於天然治療蛋白質具有增加之半衰期。在另一實施例中，前述脂肪酸衍生物包含飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸。在一相關實施例中，脂肪酸為飽和脂肪酸。在另一實施例中，脂肪酸為支鏈脂肪酸。
    預期脂肪酸衍生物中之脂肪酸具有各種長度。在一個實施例中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸包含C10與C24之間的鏈長，包括具有奇數個碳數之合成脂肪酸。在一個實施例中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸包含選自由以下組成之群的鏈長：C10、C12、C14、C16、C18、C20、C20、C22及C24。在另一實施例中，脂肪酸具有選自由C14、C16及C18組成之群的鏈長。在另一實施例中，脂肪酸具有選自由C13、C15及C17組成之群的鏈長。
    在另一實施例中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸以該脂肪酸上選自由以下組成之群之基團連接至水溶性連接子：末端羧基及ω基團。在另一實施例中，脂肪酸以ω基團連接至水溶性連接子。在另一實施例中，ω基團係選自由以下組成之群：羥基、胺基、硫基及羧基。
    在本發明之一個實施例中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸為16-羥基十六烷酸。
    在另一實施例中，提供一種脂肪酸衍生物，其中脂肪酸酯係選自由以下組成之群：甲酯及乙酯。在一個實施例中，脂肪酸酯為16-羥基十六烷酸甲酯。
    本發明中涵蓋各種水溶性連接子。在一個實施例中，提供前述脂肪酸衍生物，其中水溶性連接子包含水溶性聚合物及至少一個連接至治療蛋白質之官能基。在一個實施例中，連接至治療蛋白質之官能基能夠賦予負電荷或正電荷，由此使連接子可溶於水。在另一實施例中，官能基係選自由以下組成之群：磺酸基、羧基、羥基、胺基、醯胺基、順丁烯二醯亞胺基、胺氧基及醯肼基。在一個實施例中，官能基為胺氧基。
    本發明中涵蓋眾多水溶性聚合物。在一個實施例中，提供前述脂肪酸衍生物，其中作為連接子之整體部分之水溶性聚合物係選自由以下組成之群：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羥烷基澱粉(HAS)、羥乙基澱粉(HES)、碳水化合物、多醣、支鏈澱粉、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)及磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)。在另一實施例中，水溶性聚合物為PEG。本文中亦涵蓋各種長度之水溶性聚合物。在一個實施例中，提供一種脂肪酸衍生物，其中水溶性聚合物包含選自由以下組成之群的鏈長：O3、O5、O7、O9、O11、O13及O15。
    在一個實施例中，提供一種脂肪酸衍生物，其中水溶性連接子係選自由以下組成之群：
    3-氧雜戊烷-1,5-二氧基胺
    3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二氧基胺
    3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1,17-二氧基胺
    3,6,9,12,15,18,21-七氧雜二十三烷-1,23-二氧基胺
    在本發明之另一實施例中，提供一種脂肪酸衍生物，其中脂肪酸衍生物藉由肟鍵聯穩定連接至治療蛋白質。在另一實施例中，肟鍵聯在水溶性連接子上之肟基與治療蛋白質上經氧化碳水化合物之醛基之間形成。
    在本發明之另一實施例中，提供一種脂肪酸衍生物，其中脂肪酸衍生物藉由水溶性連接子上之順丁烯二醯亞胺基連接至治療蛋白質上之游離巰基而穩定連接至治療蛋白質。在另一實施例中，脂肪酸衍生物藉由水溶性連接子上之N-羥基丁二醯亞胺酯連接至治療蛋白質上之游離胺基而穩定連接至治療蛋白質。
    在本發明之一個實施例中，提供一種脂肪酸衍生物，其中脂肪酸衍生物係選自由以下組成之群：
    a)下式之16-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基亞胺基)-十六烷酸鈉鹽：
    b)16-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基胺基)-十六烷酸甲酯：
    本發明中涵蓋各種治療蛋白質。在一個實施例中，提供前述脂肪酸衍生物，其中治療蛋白質係選自由以下組成之群：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威勒布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質C、蛋白質S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)、ADAMTS 13蛋白酶、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、群落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、EPO、干擾素-α(IFN-α)、複合干擾素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、血管位蛋白樣多肽1(ANGPTL1)、血管位蛋白樣多肽2(ANGPTL2)、血管位蛋白樣多肽3(ANGPTL3)、血管位蛋白樣多肽4(ANGPTL4)、血管位蛋白樣多肽5(ANGPTL5)、血管位蛋白樣多肽6(ANGPTL6)、血管位蛋白樣多肽7(ANGPTL7)、玻黏蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨型態發生蛋白-1、骨型態發生蛋白-2、骨型態發生蛋白-3、骨型態發生蛋白-4、骨型態發生蛋白-5、骨型態發生蛋白-6、骨型態發生蛋白-7、骨型態發生蛋白-8、骨型態發生蛋白-9、骨型態發生蛋白-10、骨型態發生蛋白-11、骨型態發生蛋白-12、骨型態發生蛋白-13、骨型態發生蛋白-14、骨型態發生蛋白-15、骨型態發生蛋白受體IA、骨型態發生蛋白受體IB、骨型態發生蛋白受體II、腦源性神經營養因子、心臟營養素-1、睫狀神經營養因子、睫狀神經營養因子受體、畸胎癌衍生生長因子(cripto)、潛伏蛋白(cryptic)、細胞激素誘導之嗜中性球趨化因子1、細胞激素誘導之嗜中性球趨化因子2α、細胞激素誘導之嗜中性球趨化因子2β、β內皮細胞生長因子、內皮素1、表皮生長因子、表皮素(epigen)、表皮調節素(epiregulin)、上皮衍生嗜中性球引誘劑、纖維母細胞生長因子4、纖維母細胞生長因子5、纖維母細胞生長因子6、纖維母細胞生長因子7、纖維母細胞生長因子8、纖維母細胞生長因子8b、纖維母細胞生長因子8c、纖維母細胞生長因子9、纖維母細胞生長因子10、纖維母細胞生長因子11、纖維母細胞生長因子12、纖維母細胞生長因子13、纖維母細胞生長因子16、纖維母細胞生長因子17、纖維母細胞生長因子19、纖維母細胞生長因子20、纖維母細胞生長因子21、酸性纖維母細胞生長因子、鹼性纖維母細胞生長因子、神經膠質細胞系衍生神經營養因子受體α1、神經膠質細胞系衍生神經營養因子受體α2、生長相關蛋白、生長相關蛋白α、生長相關蛋白β、生長相關蛋白γ、肝素結合表皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、肝細胞瘤衍生生長因子、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結合蛋白、角化細胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子α、神經生長因子、神經生長因子受體、神經生成素、神經營養蛋白-3、神經營養蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板衍生內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子、血小板衍生生長因子A鏈、血小板衍生生長因子AA、血小板衍生生長因子AB、血小板衍生生長因子B鏈、血小板衍生生長因子BB、血小板衍生生長因子受體α、血小板衍生生長因子受體β、前B細胞生長刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受體、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、轉型生長因子α、轉型生長因子β、轉型生長因子β1、轉型生長因子β1.2、轉型生長因子β2、轉型生長因子β3、轉型生長因子β5、潛伏轉型生長因子β1、轉型生長因子β結合蛋白I、轉型生長因子β結合蛋白II、轉型生長因子β結合蛋白III、胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)、腫瘤壞死因子受體I型、腫瘤壞死因子受體II型、尿激酶型纖溶酶原活化因子受體、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰島素、植物凝集素蓖麻毒素、催乳素、絨毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲狀腺素、組織纖溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA及IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黃體化激素、雌激素、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、轉鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、Humira(阿達木單抗(adalimumab))、Prolia(迪諾賽單抗(denosumab))、Enbrel(依那西普(etanercept))、表1中之蛋白質、或其生物活性片段、衍生物或變異體。在另一實施例中，治療蛋白質為FVIIa。在另一實施例中，治療蛋白質為FVIII。在另一實施例中，治療蛋白質為FIX。
    本文亦涵蓋製備脂肪酸衍生物之方法。在一個實施例中，提供一種製備本文所述之脂肪酸衍生物之方法，其包括：a)氧化脂肪酸上之ω-羥基以在該脂肪酸上產生醛基；及b)使包含活性胺氧基之水溶性連接子與該醛基偶合以形成穩定肟鍵聯，其中該脂肪酸衍生物可溶於水。在一個實施例中，提供前述方法，其中藉由選自由以下組成之群之氧化試劑氧化ω-羥基：戴斯馬丁高碘烷試劑(Dess Martin periodinane reagent)、Tempo試劑、利用乙二醯氯/DMSO進行斯文氧化(Swern oxidation)、過釕酸四丙銨(TPAP)、鉻VI試劑，諸如柯林斯試劑(Collins reagent)、氯鉻酸吡錠(PCC)及重鉻酸吡錠。在另一實施例中，氧化試劑為戴斯馬丁高碘烷。
    在另一實施例中，提供前述方法，其中脂肪酸為飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸。在另一實施例中，脂肪酸為飽和脂肪酸。
    在本發明之另一實施例中，提供前述方法，其中脂肪酸為支鏈脂肪酸。
    根據另一實施例，亦提供前述方法，其中脂肪酸包含C10與C24之間的鏈長，包括具有奇數個碳數之合成脂肪酸。在一個實施例中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸包含選自由以下組成之群的鏈長：C10、C12、C14、C16、C18、C20、C20、C22及C24。在另一實施例中，脂肪酸具有選自由C14、C16及C18組成之群的鏈長。在另一實施例中，脂肪酸具有選自由C13、C15及C17組成之群的鏈長。
    在另一實施例中，提供前述方法，其中水溶性連接子包含水溶性聚合物及至少一個胺氧基。
    本發明中預期眾多水溶性聚合物用於前述方法中。在一個實施例中，提供前述方法，其中水溶性聚合物係選自由以下組成之群：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羥烷基澱粉(HAS)、羥乙基澱粉(HES)、碳水化合物、多醣、支鏈澱粉、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)及磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)。在一個實施例中，水溶性聚合物為PEG。
    亦涵蓋各種長度之水溶性聚合物。在一個實施例中，提供前述方法，其中水溶性聚合物包含選自由以下組成之群的鏈長：O5、O7、O9、O11、O13及O15。
    在另一實施例中，提供前述方法，其中水溶性連接子係選自由以下組成之群：
    a)　下式之3-氧雜戊烷-1,5-二氧基胺：
    b)　下式之3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二氧基胺：
    c)　下式之3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1,17-二氧基胺：
    d)　下式之3,6,9,12,15,18,21-七氧雜二十三烷-1,23-二氧基胺：
    在另一實施例中，提供前述方法，其中水溶性連接子為下式之3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二氧基胺：
    在另一實施例中，提供前述方法，其中水溶性連接子為下式之3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1,17-二氧基胺：
    本文中涵蓋製備脂肪酸衍生物之其他方法。在一個實施例中，提供一種製備前述脂肪酸衍生物之方法，其包括：a)酯化脂肪酸上之羧基以在脂肪酸上產生酯；b)藉由在步驟a)之脂肪酸上引入甲磺醯基活化脂肪酸上之ω-羥基；及c)藉由取代步驟b)之甲磺醯基偶合包含活性胺氧基之水溶性連接子，由此形成穩定的氧基胺-亞甲基鍵；其中該脂肪酸衍生物可溶於水。
    在一個實施例中，提供前述方法，其中藉由選自由以下組成之群之酯化劑酯化羧基：乙醯氯、酸存在下之甲醇、酸存在下之乙醇、重氮甲烷及碘甲烷。在另一實施例中，酯化劑為乙醯氯。
    在另一實施例中，提供前述方法，其中藉由選自由以下組成之群之活化劑活化ω-羥基：甲磺醯氯、甲苯磺醯氯及硝基苯磺醯氯。在一個實施例中，活化劑為甲磺醯氯。
    預期各種脂肪酸可用於前述方法中。在一個實施例中，提供前述方法，其中脂肪酸為飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸。在另一實施例中，脂肪酸為飽和脂肪酸。在另一實施例中，脂肪酸為支鏈脂肪酸。
    在另一實施例中，提供前述方法，其中脂肪酸包含C10與C24之間的鏈長，包括具有奇數個碳數之合成脂肪酸。在一個實施例中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸包含選自由以下組成之群的鏈長：C10、C12、C14、C16、C18、C20、C20、C22及C24。在另一實施例中，脂肪酸具有選自由C14、C16及C18組成之群的鏈長。在另一實施例中，脂肪酸具有選自由C13、C15及C17組成之群的鏈長。
    亦預期各種水溶性聚合物用於前述方法中。在一個實施例中，提供前述方法，其中水溶性連接子包含水溶性聚合物及至少一個胺氧基。在另一實施例中，水溶性聚合物係選自由以下組成之群：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羥烷基澱粉(HAS)、羥乙基澱粉(HES)、碳水化合物、多醣、支鏈澱粉、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)及磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)。在另一實施例中，水溶性聚合物為PEG。
    在本發明之另一實施例中，提供前述方法，其中水溶性聚合物包含選自由以下組成之群的鏈長：O3、O5、O7、O9、O11、O13及O15。在另一實施例中，水溶性連接子係選自由以下組成之群：[0050]
    本發明中亦涵蓋製備偶聯蛋白質之方法。在一個實施例中，提供一種製備偶聯治療蛋白質之方法，其包括：使治療蛋白質上氧化之碳水化合物部分與前述脂肪酸衍生物(或如本文所述之水溶性聚合物)在允許偶聯之條件下接觸；該碳水化合物部分藉由與包含選自由過碘酸鈉(NaIO4)、四乙酸鉛(Pb(OAc)4)及過釕酸鉀(KRuO4)組成之群之氧化劑的緩衝液一起培育而氧化；其中肟鍵聯在氧化之碳水化合物部分與脂肪酸衍生物上之活性胺氧基之間形成；並且其中肟鍵聯形成由選自由以下組成之群之親核性催化劑催化：鄰胺基苯甲酸、間胺基苯甲酸、對胺基苯甲酸、磺胺酸、鄰胺基苯甲醯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰甲氧基苯胺、間甲氧基苯胺及對甲氧基苯胺。
    在另一實施例中，提供前述方法，其中治療蛋白質係選自由以下組成之群：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威勒布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質C、蛋白質S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)、ADAMTS 13蛋白酶、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、群落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、EPO、干擾素-α(IFN-α)、複合干擾素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、血管位蛋白樣多肽1(ANGPTL1)、血管位蛋白樣多肽2(ANGPTL2)、血管位蛋白樣多肽3(ANGPTL3)、血管位蛋白樣多肽4(ANGPTL4)、血管位蛋白樣多肽5(ANGPTL5)、血管位蛋白樣多肽6(ANGPTL6)、血管位蛋白樣多肽7(ANGPTL7)、玻黏蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨型態發生蛋白-1、骨型態發生蛋白-2、骨型態發生蛋白-3、骨型態發生蛋白-4、骨型態發生蛋白-5、骨型態發生蛋白-6、骨型態發生蛋白-7、骨型態發生蛋白-8、骨型態發生蛋白-9、骨型態發生蛋白-10、骨型態發生蛋白-11、骨型態發生蛋白-12、骨型態發生蛋白-13、骨型態發生蛋白-14、骨型態發生蛋白-15、骨型態發生蛋白受體IA、骨型態發生蛋白受體IB、骨型態發生蛋白受體II、腦源性神經營養因子、心臟營養素-1、睫狀神經營養因子、睫狀神經營養因子受體、畸胎癌衍生生長因子、潛伏蛋白、細胞激素誘導之嗜中性球趨化因子1、細胞激素誘導之嗜中性球趨化因子2α、細胞激素誘導之嗜中性球趨化因子2β、β內皮細胞生長因子、內皮素1、表皮生長因子、表皮素、表皮調節素、上皮衍生嗜中性球引誘劑、纖維母細胞生長因子4、纖維母細胞生長因子5、纖維母細胞生長因子6、纖維母細胞生長因子7、纖維母細胞生長因子8、纖維母細胞生長因子8b、纖維母細胞生長因子8c、纖維母細胞生長因子9、纖維母細胞生長因子10、纖維母細胞生長因子11、纖維母細胞生長因子12、纖維母細胞生長因子13、纖維母細胞生長因子16、纖維母細胞生長因子17、纖維母細胞生長因子19、纖維母細胞生長因子20、纖維母細胞生長因子21、酸性纖維母細胞生長因子、鹼性纖維母細胞生長因子、神經膠質細胞系衍生神經營養因子受體α1、神經膠質細胞系衍生神經營養因子受體α2、生長相關蛋白、生長相關蛋白α、生長相關蛋白β、生長相關蛋白γ、肝素結合表皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、肝細胞瘤衍生生長因子、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結合蛋白、角化細胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子α、神經生長因子、神經生長因子受體、神經生成素、神經營養蛋白-3、神經營養蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板衍生內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子、血小板衍生生長因子A鏈、血小板衍生生長因子AA、血小板衍生生長因子AB、血小板衍生生長因子B鏈、血小板衍生生長因子BB、血小板衍生生長因子受體α、血小板衍生生長因子受體β、前B細胞生長刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受體、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、轉型生長因子α、轉型生長因子β、轉型生長因子β1、轉型生長因子β1.2、轉型生長因子β2、轉型生長因子β3、轉型生長因子β5、潛伏轉型生長因子β1、轉型生長因子β結合蛋白I、轉型生長因子β結合蛋白II、轉型生長因子β結合蛋白III、胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)、腫瘤壞死因子受體I型、腫瘤壞死因子受體II型、尿激酶型纖溶酶原活化因子受體、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰島素、植物凝集素蓖麻毒素、催乳素、絨毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲狀腺素、組織纖溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA及IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黃體化激素、雌激素、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、轉鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、Humira(阿達木單抗(adalimumab))、Prolia(迪諾賽單抗(denosumab))、Enbrel(依那西普(etanercept))、表1中之蛋白質、或其生物活性片段、衍生物或變異體。
    在另一實施例中，提供前述方法，其中治療蛋白質為FVIIa。在另一實施例中，提供前述方法，其中治療蛋白質為FVIII。在另一實施例中，提供前述方法，其中治療蛋白質為FIX。
    在另一實施例中，提供前述方法，其中氧化劑為過碘酸鈉(NaIO4)。在另一實施例中，提供前述方法，其中親核性催化劑為間甲苯胺。
    在另一實施例中，提供前述方法，其進一步包括純化經偶聯之治療蛋白質。
    在另一實施例中，提供前述方法，其中藉由如本文所述之方法製備脂肪酸衍生物。
    本發明亦涵蓋製備脂肪酸衍生物之其他方法。在一個實施例中，提供一種製備前述脂肪酸衍生物之方法，其包括：a)酯化脂肪酸上之羧基以在該脂肪酸上產生酯；及b)使包含活性順丁烯二醯亞胺基之水溶性連接子與游離巰基(SH)偶合，由此形成穩定的硫醚鍵；其中該脂肪酸衍生物可溶於水。
    在另一實施例中，提供一種製備前述脂肪酸衍生物之方法，其包括：a)酯化脂肪酸上之羧基以產生脂肪酸酯；b)使由步驟a)產生之脂肪酸與疊氮試劑反應由此產生相應脂肪酸疊氮化物；c)氫化步驟b)之脂肪酸疊氮化物以產生相應脂肪酸胺；及d)使包含活性NHS基團之水溶性連接子與游離胺基偶合，由此形成穩定的鍵；其中該脂肪酸衍生物可溶於水。
    治療蛋白質之藥理學及免疫學性質可藉由利用聚合化合物(諸如本發明之脂肪酸及脂肪酸衍生物)進行化學修飾及偶聯而得到改良。
    添加如本文所述之水溶性脂肪酸衍生物為一種改良治療蛋白質之性質的方法，該等治療蛋白質諸如凝血蛋白質因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威勒布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質C、蛋白質S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)或ADAMTS 13蛋白酶，以及其他已知蛋白質或其生物活性/治療活性片段。
    治療蛋白質
    在本發明之某些實施例中，前述多肽及聚核苷酸由以下治療蛋白質示例：酶、抗原、抗體、受體、凝血蛋白、生長因子、激素及配位體。在某些實施例中，治療蛋白質為凝血蛋白，諸如因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威勒布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質C、蛋白質S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)或ADAMTS 13蛋白酶。
    在某些實施例中，治療蛋白質為免疫球蛋白、細胞激素，諸如IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、群落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、EPO、干擾素-α(IFN-α)、複合干擾素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、血管位蛋白，例如Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、人類血管位蛋白樣多肽ANGPTL1至7、玻黏蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨型態發生蛋白-1、骨型態發生蛋白-2、骨型態發生蛋白-3、骨型態發生蛋白-4、骨型態發生蛋白-5、骨型態發生蛋白-6、骨型態發生蛋白-7、骨型態發生蛋白-8、骨型態發生蛋白-9、骨型態發生蛋白-10、骨型態發生蛋白-11、骨型態發生蛋白-12、骨型態發生蛋白-13、骨型態發生蛋白-14、骨型態發生蛋白-15、骨型態發生蛋白受體IA、骨型態發生蛋白受體IB、骨型態發生蛋白受體II、腦源性神經營養因子、心臟營養素-1、睫狀神經營養因子、睫狀神經營養因子受體、畸胎癌衍生生長因子、潛伏蛋白、細胞激素誘導之嗜中性球趨化因子1、細胞激素誘導之嗜中性球趨化因子2α、細胞激素誘導之嗜中性球趨化因子2β、β內皮細胞生長因子、內皮素1、表皮生長因子、表皮素、表皮調節素、上皮衍生嗜中性球引誘劑、纖維母細胞生長因子4、纖維母細胞生長因子5、纖維母細胞生長因子6、纖維母細胞生長因子7、纖維母細胞生長因子8、纖維母細胞生長因子8b、纖維母細胞生長因子8c、纖維母細胞生長因子9、纖維母細胞生長因子10、纖維母細胞生長因子11、纖維母細胞生長因子12、纖維母細胞生長因子13、纖維母細胞生長因子16、纖維母細胞生長因子17、纖維母細胞生長因子19、纖維母細胞生長因子20、纖維母細胞生長因子21、酸性纖維母細胞生長因子、鹼性纖維母細胞生長因子、神經膠質細胞系衍生神經營養因子受體α1、神經膠質細胞系衍生神經營養因子受體α2、生長相關蛋白、生長相關蛋白α、生長相關蛋白β、生長相關蛋白γ、肝素結合表皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、肝細胞瘤衍生生長因子、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結合蛋白、角化細胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子α、神經生長因子、神經生長因子受體、神經生成素、神經營養蛋白-3、神經營養蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板衍生內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子、血小板衍生生長因子A鏈、血小板衍生生長因子AA、血小板衍生生長因子AB、血小板衍生生長因子B鏈、血小板衍生生長因子BB、血小板衍生生長因子受體α、血小板衍生生長因子受體β、前B細胞生長刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受體、TNF，包括TNF0、TNF1、TNF2、轉型生長因子α、轉型生長因子β、轉型生長因子β1、轉型生長因子β1.2、轉型生長因子β2、轉型生長因子β3、轉型生長因子β5、潛伏轉型生長因子β1、轉型生長因子β結合蛋白I、轉型生長因子β結合蛋白II、轉型生長因子β結合蛋白III、胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)、腫瘤壞死因子受體I型、腫瘤壞死因子受體II型、尿激酶型纖溶酶原活化因子受體、血管內皮生長因子、嵌合蛋白及其生物活性或免疫學活性片段。
    在某些實施例中，治療蛋白質為α-干擾素、β-干擾素及γ-干擾素、群落刺激因子，包括顆粒球群落刺激因子、纖維母細胞生長因子、血小板衍生生長因子、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰島素、植物蛋白質，諸如凝集素及蓖麻毒素、腫瘤壞死因子及相關對偶基因、腫瘤壞死因子受體之可溶性形式、介白素受體及介白素受體之可溶性形式、生長因子，諸如組織生長因子，諸如TGFα或TGFβ及表皮生長因子、激素、生長調節素、色素激素、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、催乳素、絨毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲狀腺素、組織纖溶酶原活化因子及免疫球蛋白，諸如IgG、IgE、IgM、IgA及IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黃體化激素、雌激素、皮質類固醇、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、轉鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、DNA酶、整合素、凝血酶、造血生長因子、瘦素、糖苷酶、Humira(阿達木單抗)、Prolia(迪諾賽單抗)、Enbrel(依那西普)及其片段，或包含任何上述蛋白質或其片段之任何融合蛋白。除前述蛋白質外，下表1亦提供本發明所涵蓋之治療蛋白質：




















    本文提供之治療蛋白質不應視為排外的。反而是可根據本文提供之揭示內容顯而易知，本發明之方法適用於需要根據本發明連接水溶性脂肪酸衍生物之任何蛋白質。舉例而言，治療蛋白質描述於US 2007/0026485中，該文獻以引用的方式整體併入本文中。
    凝血蛋白
    在一個態樣中，本發明之起始材料為凝血蛋白，其可來源於人類血漿，或藉由重組工程改造技術產生，如以下專利中所述：美國專利第4,757,006號；美國專利第5,733,873號；美國專利第5,198,349號；美國專利第5,250,421號；美國專利第5,919,766號；及EP 306 968。
    諸如凝血蛋白之治療蛋白質由蛋白水解酶快速降解且由抗體中和，該等凝血蛋白包括因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威勒布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質C、蛋白質S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)及ADAMTS 13蛋白酶。此現象縮短其半衰期及循環時間，由此限制其治療效果。相對較高的劑量及頻繁施用為達到及維持該等治療凝血蛋白之所要治療或預防作用所必需。因此，難以獲得足夠劑量調節且需要頻繁靜脈內施用對患者之生活方式造成限制。
    如本文所述，本發明涵蓋凝血蛋白，包括但不限於因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威勒布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質C、蛋白質S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)及ADAMTS 13蛋白酶。如本文所用，術語「凝血蛋白」係指展現與特定天然凝血蛋白相關之生物活性的任何因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威勒布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質C、蛋白質S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)及ADAMTS 13蛋白酶。
    凝血級聯氛圍三個不同區段：內源性、外源性及共同途徑(Schenone等人,Curr Opin Hematol. 2004;11:272-7)。該級聯涉及一系列絲胺酸蛋白酶(酶原)及蛋白質輔因子。需要時，非活性酶原前驅體轉化為活性形式，其隨後轉化級聯中之下一酶。
    內源性途徑需要凝血因子VIII、IX、X、XI及XII。內源性途徑之起始發生於前激肽釋放素、高分子量激肽原、因子XI(FXI)及因子XII(FXII)暴露於帶負電荷之表面時。亦需要自血小板分泌之鈣離子及磷脂。
    外源性途徑在血管之血管內腔受到損傷時起始。膜醣蛋白組織因子暴露且接著結合於循環因子VII(FVII)及少量已經存在之其活化形式FVIIa。此結合促進FVII完全轉化為FVIIa且隨後在鈣及磷脂存在下促進因子IX(FIX)轉化為因子IXa(FIXa)及因子X(FX)轉化為因子Xa(FXa)。FVIIa與組織因子之結合藉由使FVII之受質(FIX及FX)結合位點更接近且藉由誘導構形變化而增強蛋白水解活性，該構形變化增強FVIIa之酶促活性。
    FX之活化為該兩條途徑之共同點。因子Va(FVa)及Xa與磷脂及鈣一起將凝血酶原轉化為凝血酶(凝血酶原酶複合物)，凝血酶接著裂解纖維蛋白原形成纖維蛋白單體。該等單體聚合形成纖維蛋白股束。因子XIIIa(FXIIIa)使此等股束彼此共價鍵結形成剛性網狀物。
    FVII轉化為FVIIa亦由多種蛋白酶催化，該等蛋白酶包括凝血酶、FIXa、FXa、因子XIa(FXIa)及因子XIIa(FXIIa)。為抑制該級聯之早期，組織因子途徑抑制劑靶向FVIIa/組織因子/FXa產物複合物。
    因子VIIa
    FVII(亦稱為穩定因子或前轉化素(proconvertin))為維生素K依賴性絲胺酸蛋白酶醣蛋白，其在止血及凝血中具有關鍵作用(Eigenbrot,Curr Protein Pept Sci. 2002;3:287-99)。
    FVII在肝臟中合成且分泌為48 kD單鏈醣蛋白。FVII與所有維生素K依賴性絲胺酸蛋白酶醣蛋白共享由以下組成之類似蛋白質域結構：負責蛋白質與脂質膜相互作用之具有9-12個殘基之胺基端γ-羧基麩胺酸(Gla)域、羧基端絲胺酸蛋白酶域(催化域)及兩個含有介導與組織因子之相互作用之鈣離子結合位點的表皮生長因子樣域。γ-麩胺醯基羧化酶催化分子之胺基端部分中Gla殘基之羧化。羧化酶依賴於維生素K之還原形式以便發揮其作用，維生素K被氧化為環氧化物形式。需要維生素K環氧化物還原酶來將維生素K之環氧化物形式再轉化為還原形式。
    FVII之主要部分在血漿中以酶原形式循環且此形式之活化導致精胺酸152與異白胺酸153之間的肽鍵裂解。所產生之活化型FVIIa由NH2來源之輕鏈(20 kD)與COOH端來源之重鏈(30 kD)經由單個二硫鍵(Cys 135至Cys 262)連接而組成。輕鏈含有膜結合Gla域，而重鏈含有催化域。
    FVII之血漿濃度由遺傳及環境因素決定，為約0.5 mg/mL(Pinotti等人，Blood. 2000;95:3423-8)。不同FVII基因型可導致平均FVII含量產生若干倍之差異。血漿FVII含量在健康女性中在懷孕期間升高，並且亦隨年齡而增加，且在女性及患有高甘油三酯血症之人中較高。在所有促凝血因子中FVII具有最短之半衰期(3-6 h)。FVIIa之平均血漿濃度在健康個體中為3.6 ng/mL，且FVIIa之循環半衰期與其他凝血因子相比相對較長(2.5 h)。
    遺傳性FVII缺乏為一種罕見的體染色體隱性出血性病症，發病率据估計在普通人群中每500,000人中即有1例(Acharya等人,J Thromb Haemost. 2004;2248-56)。因抑制劑造成的後天性FVII缺乏亦極罕見。亦已報導缺乏之發生與諸如頭孢菌素(cephalosporins)、青黴素(penicillins)及口服抗凝血劑之藥物有關之病例。此外，已報導自發發生或與其他病狀(諸如骨髓瘤、敗血症、再生障礙性貧血)、介白素-2及抗胸腺細胞球蛋白療法伴隨發生之後天性FVII缺乏。
    參考聚核苷酸及多肽序列包括例如寄存編號J02933(基因組序列)、M13232(cDNA)(Hagen等人PNAS 1986;83: 2412-6)及P08709(多肽序列)(以引用的方式整體併入本文中)。FVII之多種多型現象已有描述，例如參見Sabater-Lleal等人(Hum Genet. 2006;118:741-51)(以引用的方式整體併入本文中)。
    因子IX
    FIX為一種維生素K依賴性血漿蛋白，其藉由在鈣離子、磷脂及FVIIIa存在下將FX轉化為其活性形式而參與內源性凝血途徑。FIX之主要催化能力係作為對FX內之特定精胺酸-異白胺酸鍵具有特異性之絲胺酸蛋白酶。FIX由FXIa活化，FXIa使活化肽自FIX切除從而產生包含由一或多個二硫鍵保持之兩條鏈的活化型FIX分子。FIX缺乏為隱性X-連鎖血友病B之原因。
    血友病A及B為特徵分別在於FVIII及FIX多肽缺乏之遺傳性疾病。缺乏之根本原因常為FVIII及FIX基因突變之結果，該兩個基因均位於X染色體上。血友病之傳統療法通常涉及靜脈內施用自正常個體彙集之血漿或半純化之凝血蛋白。該等製劑可能受致病性病原體或病毒污染，諸如感染性朊病毒、HIV、細小病毒、A型肝炎及C型肝炎。因此，對不需要使用人類血清之治療劑存在迫切需要。
    FIX活性降低之程度與血友病B之嚴重程度成正比。血友病B之當前治療由以血漿來源或重組之FIX替代缺失之蛋白質(亦稱為FIX取代或替代治療或療法)。
    FIX之聚核苷酸及多肽序列例如可見於UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P00740及美國專利第6,531,298號。
    因子VIII
    凝血因子VIII(FVIII)在血漿中以極低濃度循環且與馮威勒布蘭德因子(VWF)非共價結合。在止血時，FVIII自VWF分離且藉由增強在鈣及磷脂或細胞膜存在下活化之速率而充當活化型因子IX(FIXa)介導之FX活化的輔因子。
    FVIII合成為具有結構域結構A1-A2-B-A3-C1-C2之約270-330 kD之單鏈前驅體。當自血漿純化時(例如「血漿來源」或「血漿」)，FVIII由重鏈(A1-A2-B)及輕鏈(A3-C1-C2)構成。輕鏈之分子質量為80kD，而由於B域內之蛋白水解，重鏈在90-220kD之範圍內。
    FVIII亦合成為重組蛋白以供在治療上用於出血病症。已設計各種活體外測定來測定重組FVIII(rFVIII)作為治療藥物之潛在功效。此等測定模擬內源性FVIII之活體內作用。FVIII之活體外凝血酶處理導致其促凝血活性快速增強並隨後降低，如藉由活體外測定所量測。此活化及失活與重鏈及輕鏈兩者中之特異性有限蛋白水解相符，該蛋白水解改變FVIII中不同結合抗原決定基之可用性，例如使FVIII自VWF解離及結合磷脂表面或改變與某些單株抗體之結合能力。
    FVIII缺乏或功能異常與最常出現之出血病症血友病A有關。選用於管理血友病A之治療為利用血漿來源或rFVIII濃縮物之替代療法。患有FVIII含量低於1%之嚴重血友病A之患者通常進行旨在保持FVIII在劑量之間高於1%的預防療法。考慮到循環中各種FVIII產物之平均半衰期，此結果通常可藉由每週給予FVIII兩至三次來達成。
    參考聚核苷酸及多肽序列包括例如UniProtKB/Swiss-Prot P00451(FA8_HUMAN)；Gitschier J等人,Characterization of the human Factor VIII gene,Nature,312(5992): 326-30(1984)；Vehar GH等人,Structure of human Factor VIII,Nature,312(5992):337-42(1984)；Thompson AR. Structure and Function of the Factor VIII gene and protein,Semin Thromb Hemost,2003:29;11-29(2002)。
    馮威勒布蘭德因子
    馮威勒布蘭德因子(VWF)為在血漿中以大小在約500至20,000 kD範圍內之一系列多聚體形式循環的醣蛋白。VWF之多聚體形式由250 kD多肽次單元藉由二硫鍵連接在一起構成。VWF介導血小板與受損血管壁之內皮下層的最初黏著。僅較大多聚體顯示止血活性。推測內皮細胞分泌VWF之較大聚合形式而VWF之具有低分子量之形式(低分子量VWF)由蛋白水解裂解產生。具有較大分子質量之多聚體儲存於內皮細胞之Weibel-Pallade體中且在受刺激時釋放。
    VWF由內皮細胞及巨核細胞以在很大程度上由重複結構域組成之前VWF原形式合成。信號肽裂解時，前VWF經由位於其C端區域中之二硫鍵二聚化。二聚體用作多聚化之原體，其中多聚化受制於游離末端之間的二硫鍵。組裝成多聚體後，前肽序列被蛋白水解移除(Leyte等人,Biochem. J. 274(1991),257-261)。
    根據VWF之所選殖cDNA預測的初級轉譯產物為2813個殘基之前驅多肽(前VWF原)。前VWF原由22個胺基酸之信號肽及741個胺基酸之前肽組成，其中成熟VWF包含2050個胺基酸(Ruggeri Z.A.,及Ware,J.,FASEB J.,308-316(1993))。
    VWF缺乏引起馮維勒布蘭德病(von Willebrand disease；VWD)，其特徵在於明顯程度或高或低之出血表型。3型VWD為最嚴重形式，其中VWF完全缺失，而1型VWD涉及VWF之量減少且表型可極輕微。2型VWD涉及VWF之明顯缺乏且可如同3型VWD一樣嚴重。2型VWD具有許多亞型，其中一些與高分子量多聚體之缺失或減少有關。2a型馮維勒布蘭德病(VWD-2A)之特徵在於中等及較大多聚體均缺失。VWD-2B之特徵在於最高分子量之多聚體缺失。與VWF有關之其他疾病及病症在本領域中為已知的。
    前VWF原之聚核苷酸及胺基酸序列可分別以GenBank寄存編號NM_000552及NP_000543獲得。
    本發明之其他凝血蛋白描述於本領域中，例如Mann KG,Thromb Haemost,1999;82:165-74。
    A.　多肽
    在一個態樣中，本發明之起始材料為蛋白質或多肽。如本文所述，術語治療蛋白質係指展現與治療蛋白質有關之生物活性的任何治療蛋白質分子。在本發明之一個實施例中，治療蛋白質分子為全長蛋白質。
    所涵蓋之治療蛋白質分子包括全長蛋白質、全長蛋白質之前驅體、全長蛋白質之生物活性次單元或片段、以及任何此等形式治療蛋白質之生物活性衍生物及變異體。因此，治療蛋白質包括具有以下特徵者：(1)具有與由參考核酸編碼之多肽或本文所述之胺基酸序列在至少約25個、約50個、約100個、約200個、約300個、約400個或更多個胺基酸之區域上的胺基酸序列一致性大於約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%或更高的胺基酸序列；及/和(2)特異性結合針對包含如本文所述之參考胺基酸序列之免疫原或其免疫原性片段及/或其保守性修飾變異體產生的抗體，例如多株抗體或單株抗體。
    根據本發明，術語「重組治療蛋白質」包括經由重組DNA技術獲得之任何治療蛋白質。在某些實施例中，該術語涵蓋如本文所述之蛋白質。
    如本文所用，「內源性治療蛋白質」包括來源於意欲接受治療之哺乳動物的治療蛋白質。該術語亦包括由存在於該哺乳動物中之轉殖基因或任何其他外來DNA轉錄的治療蛋白質。如本文所用，「外源性治療蛋白質」包括並非來源於意欲接受治療之哺乳動物的凝血蛋白。
    如本文所用，「血漿來源之凝血蛋白」或「血漿」包括在获自哺乳動物之血液中發現的具有參與凝血途徑之性質的蛋白質之任何形式。
    如本文所用，「生物活性衍生物」或「生物活性變異體」包括分子的具有與該分子實質上相同之功能及/或生物性質(諸如結合性質)及/或相同結構基礎(諸如肽骨架或基本聚合單元)的任何衍生物或變異體。
    「類似物」、「變異體」或「衍生物」為與天然產生之分子在結構上實質上類似且具有相同生物活性(儘管在一些情況下有一定程度的不同)之化合物。舉例而言，多肽變異體係指與參考多肽共享實質上類似之結構且具有相同生物活性之多肽。變異體或類似物與該類似物所來源之天然產生之多肽相比基於涉及以下方面之一或多個突變在其胺基酸序列組成方面有所不同：(i)多肽之一或多個末端及/或天然產生之多肽序列(例如片段)之一或多個內部區域的一或多個胺基酸殘基缺失，(ii)在多肽之一或多個末端(通常為「添加」或「融合」)及/或天然產生之多肽序列之一或多個內部區域(通常為「插入」)插入或添加一或多個胺基酸，或(iii)一或多個胺基酸取代天然產生之多肽序列的其他胺基酸。舉例而言，「衍生物」係指已修飾(例如化學修飾)的與參考多肽共享相同或實質上類似之結構的多肽。
    在各種實施例中，類似物、變異體或衍生物設計成允許例如將另一分子偶聯至蛋白質類似物、變異體或衍生物，由此形成本發明之偶聯之蛋白質。
    變異體或類似物多肽包括插入變異體，其中一或多個胺基酸殘基添加至本發明之治療蛋白質胺基酸序列。插入可位於蛋白質之任一或兩個末端，及/或可位於治療蛋白質胺基酸序列之內部區域中。在任一或兩個末端具有額外殘基之插入變異體包括例如融合蛋白及包括胺基酸標籤或其他胺基酸標記之蛋白質。在一個態樣中，凝血蛋白分子視情況含有N-端Met，尤其在分子在諸如大腸桿菌(E. coli)之細菌細胞中重組表現時。
    在缺失變異體中，如本文所述之治療蛋白質多肽中之一或多個胺基酸殘基被移除。缺失可在治療蛋白質多肽之一個或兩個末端實現，及/或藉由移除治療蛋白質胺基酸序列內部之一或多個殘基來實現。因此，缺失變異體包括治療蛋白質多肽序列之片段。
    在取代變異體中，治療蛋白質多肽之一或多個胺基酸殘基被移除且經替代殘基置換。在一個態樣中，取代在性質上為保守性的且此類型之保守性取代在本領域中為熟知的。或者，本發明涵蓋亦為非保守性之取代。示範性保守性取代描述於Lehninger,[Biochemistry,第2版；Worth Publishers,Inc.,New York(1975),第71-77頁]中且緊接著下文即進行闡述。


    或者，示範性保守性取代緊接著下文進行闡述。


    B.　聚核苷酸
    編碼本發明治療蛋白質之核酸包括例如且不限於基因、前mRNA、mRNA、cDNA、多型變異體、對偶基因、合成及天然產生之突變體。
    編碼本發明治療蛋白質之聚核苷酸亦包括但不限於具有以下特徵者：(1)在嚴格雜交條件下與編碼如本文所述之參考胺基酸序列的核酸及其保守性修飾變異體特異性雜交；(2)具有與如本文所述之參考核酸序列在至少約25個、約50個、約100個、約150個、約200個、約250個、約500個、約1000或更多個核苷酸(至多成熟蛋白質之1218個核苷酸的全長序列)之區域上的核苷酸序列一致性大於約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的核酸序列。示範性「嚴格雜交」條件包括在42℃下於50%甲醯胺、5×SSC、20 mM Na‧PO4(pH 6.8)中雜交；且在55℃下於1×SSC中洗滌30分鐘。應瞭解，此等示範性條件可基於慾雜交序列之長度及GC核苷酸含量進行變化。本領域之標準公式適於確定適當雜交條件。參見Sambrook等人,Molecular Cloning: ALaboratory Manual(第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989) §§ 9.47-9.51。
    「天然產生」之聚核苷酸或多肽序列通常來自哺乳動物，包括但不限於靈長類動物，例如人類；齧齒動物，例如大鼠、小鼠、倉鼠；牛、馬、綿羊或任何哺乳動物。本發明之核酸及蛋白質可為重組分子(例如異源分子及編碼野生型序列或其變異體之分子，或天然產生之分子)。
    C.　治療蛋白質之產生
    治療蛋白質之產生包括本領域中已知用於進行以下之任何方法：(i)藉由遺傳工程改造產生重組DNA，(ii)藉由例如但不限於轉染、電穿孔或顯微注射將重組DNA引入原核或真核細胞中，(iii)培養該經轉型之細胞，(iv)表現治療蛋白質，例如組成性表現或誘導後表現，及(v)分離該凝血蛋白，例如自培養基或藉由收集轉型細胞進行分離，以便獲得純治療蛋白質。
    在其他態樣中，治療蛋白質藉由在特徵在於產生藥理學上可接受之凝血蛋白分子之適合原核或真核宿主系統中表現來產生。真核細胞之實例為哺乳動物細胞，諸如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep及HepG2。
    多種載體用於製備治療蛋白質且選自真核及原核表現載體。用於原核表現之載體的實例包括質體，諸如但不限於pRSET、pET及pBAD，其中原核表現載體中所用之啟動子包括但不限於lac、trc、trp、recA或araBAD中之一者或多者。用於真核表現之載體的實例包括：(i)用於在酵母中表現之載體，諸如但不限於pAO、pPIC、pYES或pMET，所用之啟動子諸如但不限於AOX1、GAP、GAL1或AUG1；(ii)用於在昆蟲細胞中表現之載體，諸如但不限於pMT、pAc5、pIB、pMIB或pBAC，所用之啟動子諸如但不限於PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64或polh；及(iii)用於在哺乳動物中表現之載體，諸如但不限於pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3或pBPV，且在一個態樣中載體來源於病毒系統，諸如但不限於痘病毒、腺相關病毒、皰疹病毒或逆轉錄病毒，所用之啟動子諸如但不限於CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV及β-肌動蛋白。
    在本發明之各種實施例中，治療蛋白質藉由將水溶性脂肪酸衍生物或水溶性連接子偶聯至治療蛋白質上之一或多個碳水化合物進行修飾。因此在一個實施例中，治療蛋白質為醣蛋白且純化自允許糖基化之宿主細胞(亦即，蛋白質在活體內糖基化且隨後以醣蛋白形式純化)。在各種實施例中，治療蛋白質為或不為醣蛋白且在自宿主細胞純化後在活體外進行糖基化。活體外糖基化方法在本領域中為熟知的(參見例如Meynial-Salles I及Combes D,Journal of Biotechnology 1996,46:1-14；/SolRJ及Griebenow K,BioDrugs 2010,24:9-21)。當然，本領域之技術人員可(1)純化治療蛋白質；(2)修飾治療蛋白質以允許在活體外(視情況位點特異性)糖基化(例如胺基酸缺失/插入/取代)；及(3)根據本領域中已知之程序在活體外對經修飾蛋白質進行糖基化。
    D.　施用
    在一個實施例中，本發明之偶聯治療蛋白質可藉由注射，諸如靜脈內、肌肉內或腹膜內注射進行施用。
    為向人類或測試動物施用包含本發明之偶聯治療蛋白質的組合物，在一個態樣中，組合物包含一或多種醫藥學上可接受之載劑。術語「醫藥學上」或「藥理學上可接受」係指分子實體及組合物在使用如下文所述在本領域中熟知之路徑施用時穩定、抑制蛋白質降解(諸如聚集及裂解產物)，且此外不產生過敏反應或其他不良反應。「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有臨床上適用之溶劑、分散介質、塗料、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物，包括上文揭示之藥劑。
    如本文所用，「有效量」包括適於治療疾病或病症或緩解疾病或病症之症狀的劑量。在一個實施例中，「有效量」包括適於治療患有如本文所述之出血病症之哺乳動物的劑量。
    組合物可經口、局部外用、經皮、非經腸、藉由吸入噴霧、陰道、直腸或藉由顱內注射施用。如本文所用之術語非經腸包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、腦池內注射或輸注技術。亦涵蓋藉由靜脈內、皮內、肌肉內、乳房內、腹膜內、鞘內、眼球後、肺內注射及/或在特定部位手術植入進行施用。一般而言，組合物基本上不含熱原質以及可能會對接受者有害之其他雜質。
    組合物之單次或多次施用可採用由主治醫師選擇之劑量濃度及模式進行。為預防或治療疾病，適當劑量將取決於如上文所述慾治療疾病之類型、疾病之嚴重性及病程、藥物是出於預防抑或治療之目的施用、先前療法、患者之病史及對藥物之反應，以及主治醫師之判斷。
    本發明亦關於包含有效量之如本文所定義之偶聯治療蛋白質的醫藥組合物。醫藥組合物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、鹽、緩衝劑或賦形劑。醫藥組合物可用於治療上文定義之出血病症。本發明之醫藥組合物可為溶液或凍幹產品。醫藥組合物之溶液可經受任何適合凍幹製程。作為另一態樣，本發明包括包含本發明之組合物以有利於用於施用至受試者之方式封裝的套組。在一個實施例中，該種套組包括本文所述之化合物或組合物(例如包含偶聯治療蛋白質之組合物)封裝於諸如密封瓶或器皿之容器中，具有描述該化合物或組合物在實施方法時之使用的標籤黏附於容器上或包括於包裝中。在一個實施例中，套組含有具有包含偶聯治療蛋白質之組合物的第一容器及具有用於第一容器中之組合物之生理學上可接受之復原溶液的第二容器。在一個態樣中，化合物或組合物以單位劑型封裝。套組可進一步包括適於根據特定施用路徑施用組合物之裝置。套組較佳含有描述治療蛋白質或肽組合物之使用的標籤。
    脂肪酸、脂肪酸衍生物及蛋白質-脂肪酸衍生物偶聯物
    在一個態樣中，本文提供之治療蛋白質衍生物(亦即偶聯之治療蛋白質)分子係結合於水溶性脂肪酸衍生物。如本文所用，「水溶性脂肪酸衍生物」包含脂肪酸(亦即羧酸)偶聯於如本文所述之水溶性連接子(例如胺氧基連接子)。根據本發明，該等脂肪酸衍生物為穩定的(亦即不自蛋白質釋放)，可溶於水且能夠結合人類血清白蛋白。
    A.　脂肪酸
    脂肪酸(亦即FA或FAs)為根據本發明能夠結合人類血清白蛋白之飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、支鏈脂肪酸(Mukheriji等人,Prog Lipid Res 2003;42:359-76)及其衍生物。
    舉例而言，脂肪酸具有以下一般結構：
    飽和FA：一般結構
    飽和FA甲酯：一般結構
    飽和FA乙酯：一般結構
    根據本發明之各種實施例，脂肪酸亦包含各種替代結構(例如甲酯或乙酯)或其他結構，諸如在ω-位置含有末端基團(例如羥基、胺基、硫基及羧基)。
    在一個實施例中，脂肪酸為天然產生之脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為短鏈脂肪酸(例如少於6個碳)、中鏈脂肪酸(例如6至12個碳)、長鏈脂肪酸(例如長於12個碳)或極長鏈脂肪酸(例如長於22個碳)。在另一實施例中，脂肪酸之碳在4個與28個之間。在一個實施例中，脂肪酸呈順式組態。在另一實施例中，脂肪酸呈反式組態。
    在一個實施例中，脂肪酸為長度在12個碳與20個碳之間的飽和脂肪酸。該等脂肪酸在本領域中為已知的，例如C12(十二烷酸、月桂酸)、C14(十四烷酸、肉豆蔻酸)、C16(十六烷酸、棕櫚酸)、C18(十八烷酸、硬脂酸)及C20(二十烷酸、花生酸)。不飽和脂肪酸之實例為豆蔻油酸(C14:1)、棕櫚油酸(C16:1)、油酸(C18:1)、亞麻油酸(C18:2)及花生四烯酸(C20:4)。該等脂肪酸大多數可購得且可藉由不同化學方法製備(Recent Developments in the Synthesis of Fatty Acid Derivatives,編者：Knothe G及Derksen JTB,AOCS Press 1999,ISBN 1-893997-00-6)。
    在本發明之各種實施例中，脂肪酸包含4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50個碳。
    B.　脂肪酸衍生物
    本發明提供可結合人類血清白蛋白之一類新穎活化脂肪酸衍生物(FA衍生物)之製備方法。該等FA衍生物含有允許在水溶液中處理及操作FA衍生物之水溶性間隔子或連接子(亦即不同於本發明之脂肪酸衍生物所來源之相應脂肪酸，本發明之脂肪酸衍生物可溶於水)。在一個實施例中，該等FA衍生物含有活性胺氧基，其允許FA衍生物與治療蛋白質之氧化碳水化合物部分(主要為N-聚糖)偶合形成穩定的肟鍵聯。如本文所用，「穩定的」鍵聯意謂所形成之共價鍵「不可釋放」或不可水解。
    經由碳水化合物進行化學修飾對於如FVIII、FIX及FVIIa之凝血蛋白形成具有高殘餘活性之偶聯物而言可能為較佳選擇。
    舉例而言且不加限制，以下策略代表根據本發明製備含有活性胺氧基之水溶性FA衍生物之一個實施例。
    策略1：
    利用戴斯馬丁高碘烷對FA衍生物(例如16-羥基十六烷酸)之ω-羥基進行氧化以產生醛基。在下一步驟中，使含有水溶性PEG鏈之二胺氧基連接子(例如3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二氧基胺)與此醛基偶合以形成穩定肟鍵聯。以下流程代表根據策略1之一個實例：
    步驟1：用戴斯馬丁試劑對16-羥基硬脂酸進行選擇性氧化以產生16-側氧基硬脂酸。粗產物藉由層析使用矽膠作為分離劑進行純化。
    步驟2：使16-側氧基硬脂酸鈉鹽之16-側氧基部分與3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二氧基胺反應。粗產物藉由層析使用矽膠作為分離劑進行純化。
    或者，在另一實施例中，採用以下策略來製備含有活性胺氧基之水溶性FA衍生物。
    策略2：
    利用乙醯氯對ω-羥基脂肪酸(例如16-羥基十六烷酸)之羧基進行酯化。此甲酯衍生物之ω-羥基用甲磺醯氯活化引入更好之離去基團。接著使甲磺醯基與含有水溶性PEG鏈之二胺氧基連接子(例如3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二氧基胺)反應以形成穩定的胺氧基-亞甲基鍵。視情況可在鹼性溶液中水解甲酯以產生游離羧基。以下流程代表根據策略2之一個實例：
    步驟1：16-羥基十六烷酸之羧基部分藉由使用乙醯氯作為甲基化試劑形成甲酯加以保護。
    步驟2：藉由用甲磺醯基(其為更好之離去基團)取代羥基活化16-羥基十六烷酸甲酯之16-羥基部分。
    步驟3：16-甲磺醯基十六烷酸甲酯之16-甲磺醯基部分以雙官能3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二氧基胺之一個胺氧基部分取代。粗產物藉由層析使用矽膠作為分離劑進行純化。
    本發明亦涵蓋另一策略。本發明例如不限於利用胺氧基化學來與氧化之碳水化合物殘基的醛基偶合。如本文所述，亦涵蓋使用其他化學，包括但不限於：使用醯肼與醛基偶合、使用NHS與胺基偶合以及使用順丁烯二醯亞胺與治療蛋白質之游離SH-基團偶合。
    舉例而言，使如上文所述製備之脂肪酸甲酯與如本文所述之市售MAL-PEG-COOH(mal-PEG(12)-COOH/IRIS Biotech GmbH,Marktredwitz,Germany)反應。作為另一實例，使具有反應性胺基之脂肪酸酯與如本文所述之市售NHS-PEG-NHS(NHS-dPEG(4)-NHS/IRIS Biotech GmbH,Marktredwitz,Germany)反應。
    水溶性連接子包括但不限於水溶性聚合物(例如PEG)。連接子可由含有一或多個增加水溶性之官能基的任何化學結構組成。該等官能基可具有形成負電荷或正電荷之能力，由此使得連接子可溶於水。在一個實施例中，此官能基包括但不限於磺酸基或羧基。此外可使用任何極性官能基，其使得連接子可溶於水。其實例為羥基、胺基、醯胺基、順丁烯二醯亞胺基、胺氧基及醯肼基，以及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)酯及磺酸基NHS酯。
    在各種實施例中，水溶性連接子包括但不限於聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羥烷基澱粉(HAS)、羥乙基澱粉(HES)、碳水化合物、多醣、支鏈澱粉、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)及磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)。
    在一個實施例中，水溶性聚合物為PEG。在本發明之各種實施例中，水溶性聚合物包含約3至25個氧之間的鏈長。舉例而言，在本發明之各種實施例中，水溶性聚合物包含3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或25個氧。
    C.　蛋白質-脂肪酸衍生物偶聯物
    本發明涵蓋胺氧基連接子系統(亦即其中水溶性脂肪酸衍生物包含胺氧基連接子)。舉例而言，在本發明之一個實施例中，應用羥基胺或羥基胺衍生物與醛(例如利用過碘酸鈉進行氧化後碳水化合物部分上之醛)形成肟基的反應來製備蛋白質偶聯物。舉例而言，首先用諸如過碘酸鈉(NaIO4)之氧化劑對醣蛋白(例如本發明之治療蛋白質)進行氧化(Rothfus JA及Smith EL.,J Biol Chem 1963,238,1402-10；以及Van Lenten L及Ashwell G.,J Biol Chem 1971,246,1889-94)。醣蛋白之過碘酸鹽氧化係基於1928年描述之經典馬拉普瑞德反應(Malaprade reaction)，該反應係利用過碘酸鹽對鄰二醇進行氧化形成活性醛基(Malaprade L.,Analytical application,Bull Soc Chim France,1928,43,683-96)。該種氧化劑之其他實例為四乙酸鉛(Pb(OAc)4)、乙酸錳(MnO(Ac)3)、乙酸鈷(Co(OAc)2)、乙酸鉈(TlOAc)、硫酸鈰(Ce(SO4)2)(US 4,367,309)或過釕酸鉀(KRuO4)(Marko等人,J Am Chem Soc 1997,119,12661-2)。「氧化劑」意謂在生理學反應條件下能夠氧化碳水化合物中之鄰二醇藉此產生活性醛基之溫和氧化性化合物。
    第二步驟為含有胺氧基之聚合物(例如脂肪酸衍生物)與氧化之碳水化合物部分偶合形成肟鍵聯。在本發明之一個實施例中，此步驟可在催化量之親核性催化劑苯胺或苯胺衍生物存在下進行(Dirksen A及Dawson PE,Bioconjugate Chem. 2008；Zeng Y等人,Nature Methods 2009;6:207-9)。苯胺催化顯著加速肟連接，從而允許使用極低濃度之試劑。在本發明之另一實施例中，肟鍵聯藉由用NaCNBH3還原形成烷氧基胺鍵聯而穩定化。其他催化劑在下文描述。在另一實施例中，此步驟在間甲苯胺存在下進行。
    在本發明之一個實施例中，偶聯水溶性連接子(例如脂肪酸衍生物)與蛋白質之反應步驟分別且依序進行(亦即，起始材料(例如治療蛋白質、水溶性連接子等)、試劑(例如氧化劑、苯胺等)及反應產物(例如治療蛋白質上氧化之碳水化合物、活化之胺氧基水溶性連接子等)在個別反應步驟之間分離)。在另一實施例中，完成本發明之偶聯反應所必需之起始材料及試劑在單一容器中進行。在一個實施例中，將天然蛋白質與胺氧基-聚合物試劑混合。隨後，添加氧化劑且進行偶聯反應。
    關於胺氧基技術之其他資訊可見於以下參考文獻中，該等參考文獻各自以引用的方式整體併入本文中：EP 1681303A1(HAS化紅血球生成素)；WO 2005/014024(由肟連接基團連接之聚合物與蛋白質之偶聯物)；WO96/40662(含胺氧基連接子化合物及其在偶聯物中之應用)；WO 2008/025856(經修飾之蛋白質)；Peri F等人,Tetrahedron 1998,54,12269-78；Kubler-Kielb J及Pozsgay V.,J Org Chem 2005,70,6887-90；Lees A等人,Vaccine 2006,24(6),716-29；及Heredia KL等人,Macromolecules 2007,40(14),4772-9。
    水溶性連接子之偶合可藉由與蛋白質直接偶合(例如經由蛋白質上之游離巰基或游離胺基)或經由本文所述之連接子分子進行。在一個態樣中，偶聯藉由在形成穩定的鍵下使水溶性連接子與治療蛋白質直接偶合(或經由連接子系統偶合)來進行。
    因此，在本發明之各種實施例中，本文所述之脂肪酸衍生物設計成允許與治療蛋白質偶合。舉例而言，脂肪酸衍生物設計成包括各種末端反應性基團，如本文所述。
    在某些態樣中，治療蛋白質藉由多種化學方法中之任一種偶聯至水溶性脂肪酸衍生物(Roberts JM等人,Advan Drug Delivery Rev 2002;54:459-76)。舉例而言，在一個實施例中，藉由使用N-羥基丁二醯亞胺(NHS)酯使脂肪酸衍生物偶聯至蛋白質之游離胺基來對治療蛋白質進行修飾。在另一實施例中，使用順丁烯二醯亞胺化學來使水溶性脂肪酸衍生物偶合至游離SH基團。在另一實施例中，水溶性脂肪酸衍生物藉由使用醯肼或胺氧基化學偶合至預先氧化後之治療蛋白質之碳水化合物部分。
    在本發明之一個實施例中，藉由使用含有活性N-羥基丁二醯亞胺(NHS)酯之水溶性脂肪酸衍生物經由離胺酸殘基對治療蛋白質進行修飾。該衍生物在溫和條件下藉由形成穩定醯胺鍵與治療蛋白質之離胺酸殘基反應。
    在本發明之另一實施例中，涵蓋經由蛋白質或脂肪酸衍生物中一者上之羧基與蛋白質或脂肪酸之胺基之間的肽鍵，或蛋白質或脂肪酸衍生物之羧基與治療蛋白質或脂肪酸衍生物之羥基之間的酯鍵進行連接。治療蛋白質藉以共價鍵結至脂肪酸衍生物之另一鍵聯係經由希夫鹼(Schiff base)，例如蛋白質上之游離胺基與脂肪酸末端所形成之醛基之間反應形成的希夫鹼。在一個態樣中，所產生之希夫鹼藉由利用NaCNBH3特異性還原形成二級胺來穩定化。一替代方法為藉由在預先氧化後利用NH4Cl進行還原胺化在脂肪酸衍生物中產生末端游離胺基。可使用雙官能試劑來連接兩個胺基或兩個羥基。舉例而言，利用如BS3(雙(磺酸基丁二醯亞胺基)辛二酸酯/Pierce,Rockford,IL)之試劑使含有胺基之脂肪酸衍生物偶合至蛋白質之胺基。此外，亦例如使用如磺酸基-EMCS(N-ε-順丁烯二醯亞胺基己醯氧基)磺酸基丁二醯亞胺酯/Pierce)之異雙官能交聯試劑來連接胺基與硫醇基。
    在另一方法中，製備具有活性醯肼基之脂肪酸衍生物並使其偶合至預先氧化且產生醛官能基後之蛋白質之碳水化合物部分。
    如上所述，治療蛋白質之游離胺基與脂肪酸衍生物之1-羧基反應形成肽鍵或在1-羧酸基與蛋白質上之羥基或其他適合活性基團之間形成酯鍵。
    在各種實施例中，治療蛋白質與脂肪酸衍生物以化學計算量連接或結合(例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:7、1:8、1:9或1:10等)。在各種實施例中，1-6、7-12或13-20個脂肪酸衍生物連接至蛋白質。在其他實施例中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個脂肪酸衍生物連接至蛋白質。
    在各種實施例中，對治療蛋白質進行修飾以引入糖基化位點(亦即除天然糖基化位點以外之位點)。該等修飾可使用此項技術中已知之標準分子生物學技術來完成。此外，治療蛋白質在經由一或多個碳水化合物部分偶聯至水溶性連接子之前可在活體內或活體外糖基化。該等經糖基化之位點可用作偶聯蛋白質與水溶性連接子之目標(美國專利申請第20090028822號，美國專利申請第2009/0093399號，美國專利申請第2009/0081188號，美國專利申請第2007/0254836號，美國專利申請第2006/0111279號，及DeFrees S.等人,Glycobiology,2006,16,9,833-43)。
    在一個實施例中，與天然治療蛋白質產物相比，偶聯之蛋白質保留天然治療蛋白質產物之完全功能活性，且提供延長之活體內半衰期。在另一實施例中，相對於天然蛋白質，偶聯之蛋白質保留至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140或150百分比(%)生物活性。
    在一相關態樣中，偶聯之蛋白質及天然凝血蛋白之生物活性利用發色活性與凝血因子抗原值之比率進行測定(凝血因子：Chr：凝血因子：Ag)。
    在本發明之另一實施例中，偶聯之蛋白質之半衰期相對於天然治療蛋白質的活體內半衰期減少或增加0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
    親核性催化劑
    如本文所述，水溶性脂肪酸衍生物與治療蛋白質之偶聯可利用苯胺來催化。苯胺強烈催化醛及酮與胺形成諸如腙及肟之穩定亞胺的水相反應。下圖比較未催化與利用苯胺催化之肟連接反應(自Kohler JJ,ChemBioChem 2009;10:2147-50改編)。
    然而，考慮到與苯胺相關之眾多健康風險，需要替代催化劑。本發明提供作為替代肟連接催化劑之苯胺衍生物。該等苯胺衍生物包括但不限於鄰胺基苯甲酸、間胺基苯甲酸、對胺基苯甲酸、磺胺酸、鄰胺基苯甲醯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰甲氧基苯胺、間甲氧基苯胺及對甲氧基苯胺。下圖比較未催化與利用間甲苯胺催化之肟连接反應(PCT/US2011/45873)：
    在本發明之一個實施例中，使用間甲苯胺(亦稱為間甲苯胺、間甲基苯胺、3-甲基苯胺或3-胺基-1-甲基苯)來催化本文所述之偶聯反應。間甲苯胺與苯胺具有類似物理性質及基本上相同之pKa值(間甲苯胺：pKa 4.73，苯胺：pKa 4.63)。
    本發明之親核性催化劑適用於肟連接(例如使用胺氧基鍵聯)或腙形成(例如使用醯肼化學)。在本發明之各種實施例中，偶聯反應中所提供親核性催化劑之濃度為0.1、0.2、0.3、0.5、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50 mM。在一個實施例中，所提供之親核性催化劑在1 mM至10 mM之間。在本發明之各種實施例中，偶聯反應之pH值在4.0與7.0之間、4.5與7.0之間、5.0與6.5之間、5.0與6.5之間。在各種實施例中，偶聯反應之pH值為pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0及7.5。在一個實施例中，pH值在5.5至6.5之間。
    偶聯之蛋白質之純化
    在各種實施例中，需要對已與氧化劑一起培育之蛋白質及/或已與本發明之水溶性脂肪酸衍生物偶聯之治療蛋白質進行純化。本領域中已知眾多純化技術並且包括但不限於層析法、過濾法及沈澱法(參見例如Guide to Protein Purification,Meth. Enzymology第463卷(由Burgess RR及Deutscher MP編),第2版,Academic Press 2009)。
    以下實例不欲對本發明造成限制，而是僅為本發明之特定實施例之示例。 實例實例1製備同雙官能連接子NH2[OCH2CH2]2ONH2
    同雙官能連接子NH2[OCH2CH2]2ONH2
    根據Boturyn等人(Tetrahedron 1997;53:5485-92)在兩步驟有機反應中採用經修改的一級胺之加布裏埃爾合成法(Gabriel-Synthesis)合成含有兩個活性胺氧基之3-氧雜戊烷-1,5-二氧基胺(第1圖)。在第一步驟中，使一分子2,2-二氯二乙基醚與兩分子內-N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲醯胺在DMF中反應。藉由在乙醇中進行肼解反應自所得中間物製備所要同雙官能產物。 實例2製備同雙官能連接子NH2[OCH2CH2]6ONH2
    同雙官能連接子NH2[OCH2CH2]6ONH2
    根據Boturyn等人(Tetrahedron 1997;53:5485-92)在兩步驟有機反應中採用經修改的一級胺之加布裏埃爾合成法合成含有兩個活性胺氧基之3,6,9,12,15-五氧雜-十七烷-1,17-二氧基胺。在第一步驟中，使一分子六乙二醇二氯與兩分子內-N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲醯胺在DMF中反應。藉由在乙醇中進行肼解反應自所得中間物製備所要同雙官能產物。 實例3製備同雙官能連接子NH2[OCH2CH2]4ONH2
    根據Boturyn等人(Tetrahedron 1997;53:5485-92)在兩步驟有機反應中採用經修改的一級胺之加布裏埃爾合成法合成含有兩個活性胺氧基之同雙官能連接子NH2[OCH2CH2]4ONH2(3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二氧基胺)。在第一步驟中，使一分子雙-(2-(2-氯乙氧基)-乙基)-醚與兩分子內-N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲醯胺在DMF中反應。藉由在乙醇中進行肼解反應自所得中間物製備最終同雙官能產物。 實例4製備16-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基亞胺基)-十六烷酸鈉鹽
    根據Halligan及Nair(Arkivoc 2006(ii)101-106)及Hubbs及Heathcock(J Am Chem Soc,2003;125:12836-43)在兩步驟反應中合成脂肪酸-胺氧基連接子16-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基亞胺基)-十六烷酸鈉鹽。
    中間物1：16-側氧基十六烷酸鈉鹽
    在0℃下向16-羥基十六烷酸(800 mg，2.9 mmol)於二氯甲烷(10 ml)及四氫呋喃(20 ml)中之冷溶液(0℃)中添加戴斯馬丁高碘烷(1636 mg，3.7 mmol)。混合物在氬氣氛圍下在0℃下攪拌3.5小時且在室溫下攪拌2.5小時。接著添加硫代硫酸鈉於飽和碳酸氫鈉溶液中之15%溶液，混合物在室溫下攪拌1.5小時。用乙醚萃取中間物1，經硫酸鈉脫水後，蒸發有幾層至乾燥且藉由管柱層析使用作為分離劑之矽膠及甲苯/乙酸乙酯溶劑混合物進行純化。產率：34%(白色固體)。
    產物：16-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基亞胺基)-十六烷酸鈉鹽
    向3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二氧基胺(146 mg，0.65 mmol)於無水四氫呋喃(3 ml)中之溶液中添加中間物1(19.1 mg，0.07 mmol)。混合物在氬氣氛圍下在室溫下攪拌1.5小時。接著混合物蒸發至乾燥且藉由管柱層析使用作為分離劑之矽膠及二氯甲烷/甲醇/休尼格鹼(Huenig’s base)之溶劑混合物進行純化。產率：71%(白色固體)。
    質譜(ESI)：[M+2H]+之m/z=477,3529 實例5製備16-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基胺基)-十六烷酸甲酯
    根據Hang等人(J Am Chem Soc 2007;129:2744-5)在三步驟反應中合成脂肪酸甲酯-胺氧基連接子16-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基胺基)-十六烷酸甲酯。
    中間物1：16-羥基十六烷酸甲酯
    在0℃下在2分鐘內向16-羥基十六烷酸(3000 mg，10.79 mmol)於無水甲醇(27 ml)中之冷(0℃)溶液中添加乙醯氯(3.837 ml，53.96 mmol)，接著混合物在室溫下在氬氣氛圍下攪拌3.5小時。隨後混合物蒸發至乾燥，殘餘物溶解於二氯甲烷(100 ml)中，用飽和碳酸氫鈉溶液(2×50 ml)及鹽水溶液(1×50 ml)洗滌。經硫酸鈉脫水後，收集之有幾層蒸發至乾燥且在室溫下真空乾燥。產率：92%(白色固體)。
    中間物2：16-甲磺醯基十六烷酸甲酯
    向中間物1(2807 mg，9.80 mmol)於二氯甲烷(40 ml)中之冷溶液(0℃)中添加三乙胺(1.502 ml，10.78 mmol)，接著在0℃下在10分鐘內逐滴添加預先冷卻的甲磺醯氯(0.834 ml，10.78 mmol)於二氯甲烷(5 ml)中之溶液。混合物在0℃下攪拌30分鐘且在室溫下攪拌2.75小時。接著混合物用二氯甲烷(150 ml)稀釋，用水(1×100 ml)、飽和碳酸氫鈉溶液(2×100 ml)及鹽水溶液(1×100 ml)洗滌。經硫酸鈉脫水後，收集之有幾層蒸發至乾燥且在室溫下真空乾燥。產率：95%(白色淡黃色固體)。
    產物：16-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基胺基)-十六烷酸甲酯
    在室溫下在氬氣氛圍下經1小時向3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二氧基胺(517 mg，2.30 mmol)於無水N,N-二甲基甲醯胺(22 ml)中之溶液中逐滴添加中間物2(70 mg，0.19 mmol)於無水N,N-二甲基甲醯胺(7 ml)中之溶液；混合物在不同溫度(室溫，50℃，80℃)下攪拌2天以完成反應。接著混合物蒸發至乾燥，粗產物藉由管柱層析使用作為分離劑之矽膠及二氯甲烷/甲醇之溶劑混合物進行純化。產率：31%(無色部分固化白色油狀物)。
    質譜(ESI)：[M+H]+之m/z=493.3824 實例616-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基胺基)-十六烷酸甲酯與凝血因子VIII之碳水化合物部分的偶合
    使用兩步驟程序製備FA-rFVIII。在第一步驟中，用NaIO4氧化rFVIII且藉由陰離子交換層析(AEC)進行純化。隨後用FA-胺氧基試劑修飾氧化之rFVIII。
    用NaIO4(最終濃度200 μM)氧化rFVIII(45 mg起始材料)。30分鐘(22℃)之培育時間後，藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液(最終濃度：10 mM)終止氧化反應。氧化之rFVIII藉由陰離子交換層析利用EMD TMAE(M)進行純化。接著將25 μl 10%(w/v) 16-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基胺基)-十六烷酸甲酯(根據實例3製備)於DMSO中之溶液添加至溶離液(蛋白質濃度2 mg/ml)中且偶合反應在4℃下進行18小時。隨後藉由HIC利用苯基瓊脂糖4 FF對FA-rFVIII偶聯物進一步純化。最終藉由UF/DF使用30kD膜(MILLIPORE)濃縮溶離液。 實例716-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基胺基)-十六烷酸甲酯與凝血因子IX之碳水化合物部分的偶合
    將10 mg rFIX溶解於反應緩衝液(20 mM L-組胺酸、5 mM CaCl2、150 mM NaCl，pH 6.0)中得到2.5 mg/ml之最終濃度。向此溶液中添加5 mM NaIO4水溶液以得到100 μM之最終濃度。反應混合物在黑暗中在輕緩攪拌下在4℃下培育1小時。接著將混合物裝載至預平衡之PD-10脫鹽管柱上以便移除過量NaIO4。向此混合物中添加8 μl 10%(w/v)16-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基胺基)-十六烷酸甲酯(根據實例3製備)於DMSO中之溶液且偶合反應在4℃下在pH 6.0下進行18小時。偶聯物接著藉由IEX利用Q-瓊脂糖FF進一步純化。最終，溶離液藉由UF/DF使用Vivaspin裝置進行濃縮。 實例816-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基胺基)-十六烷酸甲酯與凝血因子VIIa之碳水化合物部分的偶合
    將10 mg rFVIIa溶解於反應緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中得到2.0 mg/ml之最終濃度。向此溶液中添加5 mM NaIO4水溶液以得到50 μM之最終濃度。反應混合物在黑暗中在輕緩攪拌下在4℃下培育1小時。接著將混合物裝載至預平衡之PD-10脫鹽管柱上以便移除過量NaIO4。向此混合物中添加8 μl 10%(w/v)16-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基胺基)-十六烷酸甲酯(根據實例3製備)於DMSO中之溶液且偶合反應在4℃下在pH 6.0下進行18小時。偶聯物接著藉由IEX利用Q-瓊脂糖FF進一步純化。最終，溶離液藉由UF/DF使用Vivaspin裝置進行濃縮。 實例916-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基胺基)-十六烷酸甲酯與凝血因子VIII之碳水化合物部分的偶合
    將10 mg rFVIII溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM NaCl、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中得到2 mg/ml之蛋白質濃度。接著將10 μl 10%(w/v)16-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基胺基)-十六烷酸甲酯(根據實例3製備)於DMSO中之溶液添加至FVIII溶液中。隨後製備親核性催化劑間甲苯胺之水溶液(50 mM)且在15分鐘內添加至混合物中以得到10 mM之最終濃度。最終添加40 mM過碘酸鈉水溶液以得到400 μM之濃度。反應混合物在黑暗中在輕緩攪拌下在22℃之溫度下培育120分鐘。接著藉由添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)以得到反應混合物中10 mM之最終濃度且培育60分鐘來終止反應。隨後將反應混合物裝載至填充有Q-瓊脂糖FF之IEX管柱(1.6×8 cm)上。管柱用20管柱體積之平衡緩衝液(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.4)洗滌且FA-rFVIII偶聯物用緩衝液B(20 mM Hepes、5. mM CaCl2、0.5 M NaCl，pH 7.4)溶離。最終使用Hepes緩衝液7.4(20 mM Hepes、150 mM NaCl、5 mM CaCl2，pH 7.4)作為透濾緩衝液利用Vivaspin裝置對產物進行UF/DF。 實例1016-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基胺基)-十六烷酸甲酯與凝血因子IX之碳水化合物部分的偶合
    將7 mg rFIX溶解於His緩衝液(20 mM His、150 mM NaCl、5 mM CaCl2，pH 6.0)中得到2 mg/ml之蛋白質濃度。接著將7 μl 10%(w/v)16-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基胺基)-十六烷酸甲酯(根據實例3製備)於DMSO中之溶液添加至FIX溶液中。隨後製備親核性催化劑間甲苯胺之水溶液(50 mM)且在15分鐘內添加至混合物中以得到10 mM之最終濃度。最終添加40 mM過碘酸鈉水溶液以得到250 μM之濃度。反應混合物在黑暗中在輕緩攪拌下在22℃之溫度下培育120分鐘。隨後在室溫下藉由添加L-半胱胺酸(最終濃度：5 mM)歷時30分鐘淬滅反應。
    藉由陰離子交換層析對FA-rFIX偶聯物進行純化。反應混合物用10 ml緩衝液A(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)稀釋且裝載至用緩衝液A平衡之5 ml HiTrap Q FF管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。使用相同緩衝液用5 CV洗滌管柱。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 7.5)溶離管柱。含有偶聯物之溶離份藉由UF/DF使用由再生纖維素製成之10 kD膜進行濃縮。以含有150 mM NaCl及5 mM CaCl2之20 mM Hepes緩衝液(pH 7.2)進行最終透濾步驟。 實例1116-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基胺基)-十六烷酸甲酯與凝血因子VIIa之碳水化合物部分的偶合
    將10 mg rFVIIa溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中。接著將10 μl 10%(w/v)16-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基胺基)-十六烷酸甲酯(根據實例3製備)於DMSO中之溶液添加至FVIIa溶液中。隨後製備親核性催化劑間甲苯胺之水溶液(50 mM)且在15分鐘內添加至混合物中以得到10 mM之最終濃度。最終添加40 mM過碘酸鈉水溶液以得到250 μM之濃度。反應混合物在黑暗中在輕緩攪拌下在22℃之溫度下培育120分鐘。隨後在室溫下藉由添加L-半胱胺酸(最終濃度：5 mM)歷時30分鐘淬滅反應。藉由陰離子交換層析對FA-rFVIIa偶聯物進行純化。反應混合物用10 ml緩衝液A(50 mM Hepes，pH 7.4)稀釋且裝載至用緩衝液A平衡之5 ml HiTrap Q FF管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。使用相同緩衝液用5 CV洗滌管柱。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 7.4)溶離管柱。含有偶聯物之溶離份藉由UF/DF使用由再生纖維素製成之10 kD膜進行濃縮。以含有150 mM NaCl及5 mM CaCl2之20 mM Hepes緩衝液(pH 7.2)進行最終透濾步驟。 實例12在親核性催化劑存在下含有活性胺氧基之FA衍生物與氧化之碳水化合物部分的偶合
    亦提供含有活性胺氧基之FA衍生物與氧化之治療蛋白質(諸如本文表1中所述之蛋白質)的偶合。
    為偶合含有胺氧基之FA衍生物，首先用(濃度：200 μM)氧化治療蛋白質(例如EPO、G-CSF或胰島素；參見表1；濃度：0.5-3 mg/ml)之碳水化合物部分(主要為N-聚糖)。接著藉由添加L-半胱胺酸(最終濃度：5 mM)終止反應，且藉由UF/DF分離試劑。透濾後，使用25 M過量添加FA胺氧基試劑(亦即FA衍生物)，且偶合反應在親核性催化劑間甲苯胺(濃度：10 mM)存在下在輕緩攪拌下在室溫下於pH 6.0下進行1小時。隨後將反應混合物裝載至離子交換(IEX)管柱上。管柱用>5 CV洗滌緩衝液洗滌且用線性NaCl梯度溶離偶聯物。最終對含有偶聯物之溶離份進行UF/DF。 實例13在親核性催化劑存在下含有活性胺氧基之FA衍生物與氧化之碳水化合物部分的偶合
    為使含有胺氧基之FA衍生物與治療蛋白質之碳水化合物部分偶合，將蛋白質(例如EPO、G-CSF或胰島素；參見表1；濃度：0.5-3 mg/ml)與NaIO4(濃度：300 μM)一起在親核性催化劑間甲苯胺(濃度：10 mM)存在下在室溫下在pH 6.0下培育1小時。接著藉由添加L-半胱胺酸(最終濃度：5 mM)終止反應，且將反應混合物裝載至離子交換(IEX)管柱上。管柱用>5 CV洗滌緩衝液洗滌且用線性NaCl梯度溶離偶聯物。最終對含有偶聯物之溶離份進行UF/DF。 實例14在親核性催化劑存在下含有活性胺氧基之FA衍生物與氧化之凝血蛋白的偶合
    可在濃度範圍為2-20 mM之親核性催化劑(諸如間甲苯胺)存在下進行含有活性胺氧基之FA衍生物與氧化之凝血蛋白(諸如FIX、FVIII及FVIIa，如上述實例中所述)的偶合。 實例15製備水溶性MAL脂肪酸連接子
    以兩步驟合成法製備在ω位含有水溶性PEG鏈且含有活性MAL基團之脂肪酸連接子。
    步驟1：製備16-羥基十六烷酸甲酯：
    根據實例3在甲醇中在室溫下用乙醯氯酯化市售16-羥基十六烷酸，得到相應甲酯(Hang等人,Chemical probes for the rapid detection of fatty-acylated proteins in mammalian cells,JACS 2007;129:2744-5)。
    步驟2：製備MAL脂肪酸連接子：
    在室溫下在THF中採用光信反應(Mitsunobu reaction)使16-羥基十六烷酸甲酯與市售MAL-PEG-COOH(mal-Peg(12)-COOH/IRIS Biotech GmbH,Marktredwitz,Germany)反應隔夜(Toyokuni等人,Synthesis of a New Heterobifunctional Linker,N-[4-(Aminooxy)butyl]-maleimide,for Facile Access to a Thiol-Reactive 18F-Labeling Agent,Bioconjugate Chem 2003;14:1253-9)。 實例16製備水溶性NHS脂肪酸連接子
    藉由使用四步驟合成法製備在ω位含有水溶性PEG鏈且含有末端活性NHS酯之脂肪酸連接子。
    步驟1：製備16-溴十六烷酸甲酯
    在回流溫度下用甲醇及催化量之濃硫酸酯化市售16-溴十六烷酸隔夜，得到相應甲酯(Zinic等人,Positionally Isomeric Organic Gelators: Structure-Gelation Study,Racemic versus Enantiomeric Gelators,and Solvation Effects,Chem Eur J 2010;16:3066-82)。
    步驟2：製備16-疊氮基十六烷酸甲酯
    使16-溴十六烷酸甲酯與疊氮化鈉在乙腈中在回流溫度下反應四天得到相應疊氮化物(Zinic等人,Positionally Isomeric Organic Gelators: Structure-Gelation Study,Racemic versus Enantiomeric Gelators,and Solvation Effects,Chem. Eur. J. 2010;16:3066-82)。
    步驟3：製備16-胺基十六烷酸甲酯
    在甲醇中在3巴下用鈀/活性炭對16-疊氮基十六烷酸甲酯進行催化氫化三小時，得到相應胺(Zinic等人,Positionally Isomeric Organic Gelators:Structure-Gelation Study,Racemic versus Enantiomeric Gelators,and Solvation Effects,Chem. Eur. J. 2010;16:3066-82)。
    步驟4：製備NHS脂肪酸連接子
    使16-胺基十六烷酸甲酯與市售NHS-PEG-NHS(NHS-dPEG(4)-NHS/IRIS Biotech GmbH,Marktredwitz,Germany)在1,4-二噁烷中在室溫下反應三天，得到NHS脂肪酸連接子(Cline等人,The Aminolysis of N-Hydroxysuccinimide Esters. A Structure-Reactivity Study,JACS 1987;109:3087-91)。 實例17蛋白質FA偶聯物之分析表徵
    藉由使用酶聯免疫吸附測定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay；ELISA)系統在活體外驗證根據本文之實例製備之FA-rFVIII、rFIX或FVIIa樣品的白蛋白結合性質。96孔盤用針對人類血清白蛋白(HSA)之多株抗體塗佈。下一步驟為用PBS-明膠緩衝液阻斷ELISA盤。接著使HSA結合於抗體，隨後結合稀釋至不同濃度之FA-蛋白質樣品。最後利用過氧化酶標記之抗VIII、抗FIX或抗FVIIa抗體偵測HSA-蛋白質樣品。使用四甲基-聯苯胺(TMB)作為受質偵測過氧化酶活性。利用ELISA讀取器在450 nm下量測顯色強度。藉由在x軸上繪出不同樣品濃度且在y軸上繪出其相應吸光度值評估FA-蛋白質與HSA之結合。 實例18製備含有胺氧基之水溶性聚乙二醇化脂肪酸連接子
    使用如實例1中所述之3-氧雜戊烷-1,5-二氧基胺在三步驟合成法中製備含有水溶性PEG鏈且在ω位具有連接至脂肪酸羧基之胺氧基部分的脂肪酸連接子。
    步驟1：製備N-(9-茀基甲氧基羰基)-3-氧雜戊烷-1,5-二氧基胺
    使3-氧雜戊烷-1,5-二氧基胺與氯甲酸9-茀基甲酯在1,4-二噁烷中在環境溫度下反應1小時。在減壓下蒸發溶液且粗產物採用矽膠層析以二氯甲烷/甲醇20/1(v/v)作為溶劑混合物進行純化，得到純的經單FMOC保護之二氧基胺(Boturyn等人,Synthesis of Fluorescent Probes for the Detection of Abasic Sites in DNA,Tetrahedron 1997；第53卷，第15號,5485-92)。
    步驟2：製備十六烷酸(2-(2-(N-(9-茀基甲氧基羰基)胺氧基)乙氧基)乙氧基)醯胺
    使N-(9-茀基甲氧基羰基)-3-氧雜戊烷-1,5-二氧基胺與市售棕櫚酸N-羥基丁二醯亞胺酯在THF中在環境溫度下反應隔夜得到經單FMOC保護之胺氧基-脂肪酸偶聯物(Jong等人,Synthesis of ceramides using N-hydroxysuccinimide esters,Journal of Lipid Research 1972；第13卷,819-22)。
    步驟3：製備十六烷酸(2-(2-胺氧基乙氧基)乙氧基)醯胺
    使經單FMOC保護之胺氧基-脂肪酸偶聯物與吡啶在二氯甲烷中在環境溫度下反應得到脫除保護基之胺氧基-脂肪酸連接子作為最終產物(Boturyn等人,Synthesis of Fluorescent Probes for the Detection of Abasic Sites in DNA,Tetrahedron 1997；第53卷，第15號,5485-92)。 實例19MAL脂肪酸連接子與A1PI之偶合
    如實例15中所述採用光信反應藉由使16-羥基十六烷酸甲酯與市售MAL-PEG-COOH(mal-Peg(12)-COOH/IRIS Biotech GmbH,Marktredwitz,Germany)反應製備含有MAL基團之脂肪酸連接子。使此連接子與A1PI之游離SH基團偶合。
    將經純化之A1PI(濃度：1 mg/ml)溶解於反應緩衝液(20 mM磷酸鹽、5 mM EDTA，pH 7.0)中且添加10 μL 5%(w/v)MAL脂肪酸連接子於DMSO中之溶液至A1PI溶液中。修飾反應在室溫下進行2小時，接著使用L-半胱胺酸(最終濃度：10 mM)進行淬滅步驟。添加L-半胱胺酸後，反應混合物在輕緩攪拌下在相同溫度下再培育1小時。經過修飾之A1PI用平衡緩衝液(25 mM磷酸鹽，pH 6.5)稀釋以將溶液導電率校正至<4.5 mS/cm，且裝載至管柱體積(CV)為5 ml之預填充HiTrap Q FF(GE-Healthcare)上。接著管柱用10 CV平衡緩衝液(流速：2 ml/min)平衡。最終用溶離緩衝液(25 mM Na2HPO4、1 M NaCl，pH 6.5)以線性梯度溶離PEG-A1PI。 實例20NHS脂肪酸連接子與凝血因子VIII之偶合
    如實例16中所述藉由使16-羥基十六烷酸甲酯與市售NHS-PEG-NHS(NHS-dPEG(4)-NHS(IRIS Biotech GmbH,Marktredwitz,Germany)反應製備含有NHS基團之脂肪酸連接子。使此連接子與凝血因子VIII之離胺酸殘基之游離胺基偶合。
    將10 mg rFVIII溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM NaCl、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中得到2 mg/ml之蛋白質濃度。接著向FVIII溶液中添加10 μl 10%(w/v)NHS脂肪酸連接子於DMSO中之溶液。反應混合物在黑暗中在輕緩攪拌下在22℃之溫度下培育120分鐘。接著藉由添加甘胺酸水溶液(1 M)以得到反應混合物中20 mM之最終濃度來終止反應。混合物在室溫下在輕緩攪拌下培育15分鐘且隨後裝載至填充有Q-瓊脂糖FF之IEX管柱(1.6×8 cm)上。管柱用20管柱體積之平衡緩衝液(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.4)洗滌且FA-rFVIII偶聯物用緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、0.5 M NaCl，pH 7.4)溶離。最終使用Hepes緩衝液7.4(20 mM Hepes、150 mM NaCl、5 mM CaCl2，pH 7.4)作為透濾緩衝液利用Vivaspin裝置對產物進行UF/DF。
    第1圖展示水溶性連接子3-氧雜戊烷-1,5-二氧基胺之合成。
    权利要求:
    Claims (79)
    [1] 一種水溶性脂肪酸衍生物，其包含脂肪酸或脂肪酸酯連接至水溶性連接子，該脂肪酸衍生物穩定連接至治療蛋白質。
    [2] 如請求項1之脂肪酸衍生物，其在活體外或活體內結合人類血清白蛋白(HSA)。
    [3] 如請求項1至2中任一項之脂肪酸衍生物，其具有相對於天然治療蛋白質增加之半衰期。
    [4] 如請求項1至3中任一項之脂肪酸衍生物，其中該脂肪酸為飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸。
    [5] 如請求項4之脂肪酸衍生物，其中該脂肪酸為飽和脂肪酸。
    [6] 如請求項4之脂肪酸衍生物，其中該脂肪酸為支鏈脂肪酸。
    [7] 如請求項1至6中任一項之脂肪酸衍生物，其中該脂肪酸包含選自由C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22及C24組成之群的鏈長。
    [8] 如請求項7之脂肪酸衍生物，其中該脂肪酸具有選自由C14、C16及C18組成之群的鏈長。
    [9] 如請求項1至8中任一項之脂肪酸衍生物，其中該脂肪酸以該脂肪酸上選自由以下組成之群的基團連接至該水溶性連接子：末端羧基及ω-基團。
    [10] 如請求項9之脂肪酸衍生物，其中該脂肪酸以該ω-基團連接至該水溶性連接子。
    [11] 如請求項10之脂肪酸衍生物，其中該ω-基團係選自由以下組成之群：羥基、胺基、硫基及羧基。
    [12] 如請求項1至3中任一項之脂肪酸衍生物，其中該脂肪酸為16-羥基十六烷酸。
    [13] 如請求項1至3中任一項之脂肪酸衍生物，其中該脂肪酸酯係選自由以下組成之群：甲酯及乙酯。
    [14] 如請求項13之脂肪酸衍生物，其中該脂肪酸酯為16-羥基十六烷酸甲酯。
    [15] 如請求項1至14中任一項之脂肪酸衍生物，其中該水溶性連接子包含水溶性聚合物及至少一個連接至該治療蛋白質之官能基。
    [16] 如請求項15之脂肪酸衍生物，其中該官能基係選自由以下組成之群：磺酸基、羧基、羥基、胺基、醯胺基、順丁烯二醯亞胺基、胺氧基及醯肼基。
    [17] 如請求項16之脂肪酸衍生物，其中該官能基為胺氧基。
    [18] 如請求項15至17中任一項之脂肪酸衍生物，其中該水溶性聚合物係選自由以下組成之群：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羥烷基澱粉(HAS)、羥乙基澱粉(HES)、碳水化合物、多醣、支鏈澱粉、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)及磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)。
    [19] 如請求項18之脂肪酸衍生物，其中該水溶性聚合物為PEG。
    [20] 如請求項15至17及19中任一項之脂肪酸衍生物，其中該水溶性聚合物包含選自由O3、O5、O7、O9、O11、O13及O15組成之群的鏈長。
    [21] 如請求項17之脂肪酸衍生物，其中該水溶性連接子係選自由以下組成之群：a)下式之3-氧雜戊烷-1,5-二氧基胺： b)下式之3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二氧基胺： c)下式之3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1,17-二氧基胺： d)下式之3,6,9,12,15,18,21-七氧雜二十三烷-1,23-二氧基胺：
    [22] 如請求項21之脂肪酸衍生物，其中該水溶性連接子為下式之3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二氧基胺：
    [23] 如請求項21之脂肪酸衍生物，其中該水溶性連接子為下式之3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1,17-二氧基胺：
    [24] 如請求項1至3中任一項之脂肪酸衍生物，其中該脂肪酸衍生物藉由肟鍵聯穩定連接至該治療蛋白質。
    [25] 如請求項24之脂肪酸衍生物，其中該肟鍵聯在該水溶性連接子上之肟基與該治療蛋白質上氧化之碳水化合物之醛基之間形成。
    [26] 如請求項1至3中任一項之脂肪酸衍生物，其中該脂肪酸衍生物藉由該水溶性連接子上之順丁烯二醯亞胺基連接至該治療蛋白質上之游離巰基而穩定連接至該治療蛋白質。
    [27] 如請求項1至3中任一項之脂肪酸衍生物，其中該脂肪酸衍生物藉由該水溶性連接子上之N-羥基丁二醯亞胺酯連接至該治療蛋白質上之游離胺基而穩定連接至該治療蛋白質。
    [28] 如請求項1至3中任一項之脂肪酸衍生物，其中該脂肪酸衍生物係選自由以下組成之群：a)下式之16-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基亞胺基)-十六烷酸鈉鹽： b)16-(2-(2-(2-(2-胺氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基胺基)-十六烷酸甲酯：
    [29] 如請求項1至28中任一項之脂肪酸衍生物，其中該治療蛋白質係選自由以下組成之群：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威勒布蘭德因子(von Willebrand Factor；VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質C、蛋白質S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)、ADAMTS 13蛋白酶、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、群落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、EPO、干擾素-α(IFN-α)、複合干擾素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、血管位蛋白樣多肽1(ANGPTL1)、血管位蛋白樣多肽2(ANGPTL2)、血管位蛋白樣多肽3(ANGPTL3)、血管位蛋白樣多肽4(ANGPTL4)、血管位蛋白樣多肽5(ANGPTL5)、血管位蛋白樣多肽6(ANGPTL6)、血管位蛋白樣多肽7(ANGPTL7)、玻黏蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨型態發生蛋白-1、骨型態發生蛋白-2、骨型態發生蛋白-3、骨型態發生蛋白-4、骨型態發生蛋白-5、骨型態發生蛋白-6、骨型態發生蛋白-7、骨型態發生蛋白-8、骨型態發生蛋白-9、骨型態發生蛋白-10、骨型態發生蛋白-11、骨型態發生蛋白-12、骨型態發生蛋白-13、骨型態發生蛋白-14、骨型態發生蛋白-15、骨型態發生蛋白受體IA、骨型態發生蛋白受體IB、骨型態發生蛋白受體II、腦源性神經營養因子、心臟營養素-1、睫狀神經營養因子、睫狀神經營養因子受體、畸胎癌衍生生長因子(cripto)、潛伏蛋白(cryptic)、細胞激素誘導之嗜中性球趨化因子1、細胞激素誘導之嗜中性球趨化因子2α、細胞激素誘導之嗜中性球趨化因子2β、β內皮細胞生長因子、內皮素1、表皮生長因子、表皮素(epigen)、表皮調節素(epiregulin)、上皮衍生嗜中性球引誘劑、纖維母細胞生長因子4、纖維母細胞生長因子5、纖維母細胞生長因子6、纖維母細胞生長因子7、纖維母細胞生長因子8、纖維母細胞生長因子8b、纖維母細胞生長因子8c、纖維母細胞生長因子9、纖維母細胞生長因子10、纖維母細胞生長因子11、纖維母細胞生長因子12、纖維母細胞生長因子13、纖維母細胞生長因子16、纖維母細胞生長因子17、纖維母細胞生長因子19、纖維母細胞生長因子20、纖維母細胞生長因子21、酸性纖維母細胞生長因子、鹼性纖維母細胞生長因子、神經膠質細胞系衍生神經營養因子受體α1、神經膠質細胞系衍生神經營養因子受體α2、生長相關蛋白、生長相關蛋白α、生長相關蛋白β、生長相關蛋白γ、肝素結合表皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、肝細胞瘤衍生生長因子、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結合蛋白、角化細胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子α、神經生長因子、神經生長因子受體、神經生成素、神經營養蛋白-3、神經營養蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板衍生內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子、血小板衍生生長因子A鏈、血小板衍生生長因子AA、血小板衍生生長因子AB、血小板衍生生長因子B鏈、血小板衍生生長因子BB、血小板衍生生長因子受體α、血小板衍生生長因子受體β、前B細胞生長刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受體、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、轉型生長因子α、轉型生長因子β、轉型生長因子β1、轉型生長因子β1.2、轉型生長因子β2、轉型生長因子β3、轉型生長因子β5、潛伏轉型生長因子β1、轉型生長因子β結合蛋白I、轉型生長因子β結合蛋白II、轉型生長因子β結合蛋白III、胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)、腫瘤壞死因子受體I型、腫瘤壞死因子受體II型、尿激酶型纖溶酶原活化因子受體、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰島素、植物凝集素蓖麻毒素、催乳素、絨毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲狀腺素、組織纖溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA及IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黃體化激素、雌激素、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、轉鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、Humira(阿達木單抗(adalimumab))、Prolia(迪諾賽單抗(denosumab))、Enbrel(依那西普(etanercept))、表1中之蛋白質、或其生物活性片段、衍生物或變異體。
    [30] 如請求項29之脂肪酸衍生物，其中該治療蛋白質為FVIIa。
    [31] 如請求項29之脂肪酸衍生物，其中該治療蛋白質為FVIII。
    [32] 如請求項29之脂肪酸衍生物，其中該治療蛋白質為FIX。
    [33] 一種製備如請求項1之脂肪酸衍生物之方法，其包括：a)氧化脂肪酸上之ω-羥基以在該脂肪酸上產生醛基；及b)使包含活性胺氧基之水溶性連接子與該醛基偶合以形成穩定肟鍵聯；其中該脂肪酸衍生物可溶於水。
    [34] 如請求項33之方法，其中藉由選自由以下組成之群之氧化試劑氧化該ω-羥基：戴斯馬丁高碘烷試劑(Dess Martin periodinane reagent)、Tempo試劑、乙二醯氯/DMSO、過釕酸四丙銨(TPAP)及鉻VI試劑(柯林斯試劑(Collins reagent)、氯鉻酸吡錠(PCC)及重鉻酸吡錠)。
    [35] 如請求項34之方法，其中該氧化試劑為戴斯馬丁高碘烷。
    [36] 如請求項33至35中任一項之方法，其中該脂肪酸為飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸。
    [37] 如請求項36之方法，其中該脂肪酸為飽和脂肪酸。
    [38] 如請求項36之方法，其中該脂肪酸為支鏈脂肪酸。
    [39] 如請求項33至37中任一項之方法，其中該脂肪酸包含選自由C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22及C24組成之群的鏈長。
    [40] 如請求項39之方法，其中該脂肪酸具有選自由C14、C16及C18組成之群的鏈長。
    [41] 如請求項40之方法，其中該脂肪酸為16-羥基十六烷酸。
    [42] 如請求項33至41中任一項之方法，其中該水溶性連接子包含水溶性聚合物及至少一個胺氧基。
    [43] 如請求項42之方法，其中該水溶性聚合物係選自由以下組成之群：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羥烷基澱粉(HAS)、羥乙基澱粉(HES)、碳水化合物、多醣、支鏈澱粉、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)及磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)。
    [44] 如請求項43之方法，其中該水溶性聚合物為PEG。
    [45] 如請求項42或44中任一項之方法，其中該水溶性聚合物包含選自由O5、O7、O9、O11、O13及O15組成之群的鏈長。
    [46] 如請求項45之方法，其中該水溶性連接子係選自由以下組成之群：a)下式之3-氧雜戊烷-1,5-二氧基胺： b)下式之3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二氧基胺： c)下式之3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1,17-二氧基胺： d)下式之3,6,9,12,15,18,21-七氧雜二十三烷-1,23-二氧基胺：
    [47] 如請求項46之脂肪酸衍生物，其中該水溶性連接子為下式之3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二氧基胺：
    [48] 如請求項46之脂肪酸衍生物，其中該水溶性連接子為下式之3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1,17-二氧基胺：
    [49] 一種製備如請求項1之脂肪酸衍生物之方法，其包括：a)酯化脂肪酸上之羧基以在該脂肪酸上產生酯；b)活化脂肪酸上之ω-羥基以在步驟a)之該脂肪酸上產生甲磺醯基；及c)藉由取代步驟b)之該甲磺醯基偶合包含活性胺氧基之水溶性連接子，由此形成穩定的氧基亞胺-亞甲基鍵；其中該脂肪酸衍生物可溶於水。
    [50] 如請求項49之方法，其中藉由選自由以下組成之群之酯化劑酯化該羧基：乙醯氯、酸存在下之甲醇、酸存在下之乙醇、重氮甲烷及碘甲烷。
    [51] 如請求項50之方法，其中該酯化劑為乙醯氯。
    [52] 如請求項49至51中任一項之方法，其中藉由選自由以下組成之群之活化劑活化該ω-羥基：甲磺醯氯、甲苯磺醯氯及硝基苯磺醯氯。
    [53] 如請求項52之方法，其中該活化劑為甲磺醯氯。
    [54] 如請求項49至53中任一項之方法，其中該脂肪酸為飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸。
    [55] 如請求項54之方法，其中該脂肪酸為飽和脂肪酸。
    [56] 如請求項54之方法，其中該脂肪酸為支鏈脂肪酸。
    [57] 如請求項49至54中任一項之方法，其中該脂肪酸包含選自由C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22及C24組成之群的鏈長。
    [58] 如請求項57之方法，其中該脂肪酸具有選自由以下組成之群的鏈長：C14、C16及C18。
    [59] 如請求項58之方法，其中該脂肪酸為16-羥基十六烷酸。
    [60] 如請求項49至59中任一項之方法，其中該水溶性連接子包含水溶性聚合物及至少一個胺氧基。
    [61] 如請求項60之方法，其中該水溶性聚合物係選自由以下組成之群：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羥烷基澱粉(HAS)、羥乙基澱粉(HES)、碳水化合物、多醣、支鏈澱粉、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚伸烷基氧化物(PAO)、聚伸烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)及磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)。
    [62] 如請求項61之方法，其中該水溶性聚合物為PEG。
    [63] 如請求項60或62中任一項之方法，其中該水溶性聚合物包含選自由O3、O5、O7、O9、O11、O13及O15組成之群的鏈長。
    [64] 如請求項63之方法，其中該水溶性連接子係選自由以下組成之群：a)下式之3-氧雜戊烷-1,5-二氧基胺： b)下式之3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二氧基胺： c)下式之3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1,17-二氧基胺： d)下式之3,6,9,12,15,18,21-七氧雜二十三烷-1,23-二氧基胺：
    [65] 如請求項64之脂肪酸衍生物，其中該水溶性連接子為下式之3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二氧基胺：
    [66] 如請求項64之脂肪酸衍生物，其中該水溶性連接子為下式之3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1,17-二氧基胺：
    [67] 一種製備偶聯之治療蛋白質之方法，其包括使該治療蛋白質上氧化之碳水化合物部分與如請求項1之脂肪酸衍生物在允許偶聯之條件下接觸；該碳水化合物藉由與包含選自由過碘酸鈉(NaIO4)、四乙酸鉛(Pb(OAc)4)及過釕酸鉀(KRuO4)組成之群之氧化劑的緩衝液一起培育而氧化；其中在該氧化之碳水化合物部分與該脂肪酸衍生物上之活性胺氧基之間形成肟鍵聯；並且該肟鍵聯形成由選自由以下組成之群之親核性催化劑催化：苯胺、鄰胺基苯甲酸、間胺基苯甲酸、對胺基苯甲酸、磺胺酸、鄰胺基苯甲醯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰甲氧基苯胺、間甲氧基苯胺及對甲氧基苯胺。
    [68] 如請求項67之方法，其中該治療蛋白質係選自由以下組成之群：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威勒布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質C、蛋白質S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)、ADAMTS 13蛋白酶、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、群落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、EPO、干擾素-α(IFN-α)、複合干擾素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、血管位蛋白樣多肽1(ANGPTL1)、血管位蛋白樣多肽2(ANGPTL2)、血管位蛋白樣多肽3(ANGPTL3)、血管位蛋白樣多肽4(ANGPTL4)、血管位蛋白樣多肽5(ANGPTL5)、血管位蛋白樣多肽6(ANGPTL6)、血管位蛋白樣多肽7(ANGPTL7)、玻黏蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨型態發生蛋白-1、骨型態發生蛋白-2、骨型態發生蛋白-3、骨型態發生蛋白-4、骨型態發生蛋白-5、骨型態發生蛋白-6、骨型態發生蛋白-7、骨型態發生蛋白-8、骨型態發生蛋白-9、骨型態發生蛋白-10、骨型態發生蛋白-11、骨型態發生蛋白-12、骨型態發生蛋白-13、骨型態發生蛋白-14、骨型態發生蛋白-15、骨型態發生蛋白受體IA、骨型態發生蛋白受體IB、骨型態發生蛋白受體II、腦源性神經營養因子、心臟營養素-1、睫狀神經營養因子、睫狀神經營養因子受體、畸胎癌衍生生長因子、潛伏蛋白、細胞激素誘導之嗜中性球趨化因子1、細胞激素誘導之嗜中性球趨化因子2α、細胞激素誘導之嗜中性球趨化因子2β、β內皮細胞生長因子、內皮素1、表皮生長因子、表皮素、表皮調節素、上皮衍生嗜中性球引誘劑、纖維母細胞生長因子4、纖維母細胞生長因子5、纖維母細胞生長因子6、纖維母細胞生長因子7、纖維母細胞生長因子8、纖維母細胞生長因子8b、纖維母細胞生長因子8c、纖維母細胞生長因子9、纖維母細胞生長因子10、纖維母細胞生長因子11、纖維母細胞生長因子12、纖維母細胞生長因子13、纖維母細胞生長因子16、纖維母細胞生長因子17、纖維母細胞生長因子19、纖維母細胞生長因子20、纖維母細胞生長因子21、酸性纖維母細胞生長因子、鹼性纖維母細胞生長因子、神經膠質細胞系衍生神經營養因子受體α1、神經膠質細胞系衍生神經營養因子受體α2、生長相關蛋白、生長相關蛋白α、生長相關蛋白β、生長相關蛋白γ、肝素結合表皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、肝細胞瘤衍生生長因子、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結合蛋白、角化細胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子α、神經生長因子、神經生長因子受體、神經生成素、神經營養蛋白-3、神經營養蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板衍生內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子、血小板衍生生長因子A鏈、血小板衍生生長因子AA、血小板衍生生長因子AB、血小板衍生生長因子B鏈、血小板衍生生長因子BB、血小板衍生生長因子受體α、血小板衍生生長因子受體β、前B細胞生長刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受體、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、轉型生長因子α、轉型生長因子β、轉型生長因子β1、轉型生長因子β1.2、轉型生長因子β2、轉型生長因子β3、轉型生長因子β5、潛伏轉型生長因子β1、轉型生長因子β結合蛋白I、轉型生長因子β結合蛋白II、轉型生長因子β結合蛋白III、胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)、腫瘤壞死因子受體I型、腫瘤壞死因子受體II型、尿激酶型纖溶酶原活化因子受體、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰島素、植物凝集素蓖麻毒素、催乳素、絨毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲狀腺素、組織纖溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA及IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黃體化激素、雌激素、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、轉鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、Humira(阿達木單抗(adalimumab))、Prolia(迪諾賽單抗(denosumab))、Enbrel(依那西普(etanercept))、表1中之蛋白質、或其生物活性片段、衍生物或變異體。
    [69] 如請求項67至68中任一項之方法。
    [70] 如請求項67至69中任一項之方法，其中該治療蛋白質為FVIIa。
    [71] 如請求項67至69中任一項之方法，其中該治療蛋白質為FVIII。
    [72] 如請求項67至69中任一項之方法，其中該治療蛋白質為FIX。
    [73] 如請求項67至72中任一項之方法，其中該氧化劑為過碘酸鈉(NaIO4)。
    [74] 如請求項67至73中任一項之方法，其中該親核性催化劑為間甲苯胺。
    [75] 如請求項67至74中任一項之方法，其進一步包括純化該經偶聯之治療蛋白質。
    [76] 如請求項67至75中任一項之方法，其中該脂肪酸衍生物係藉由如請求項33至47中任一項之方法製備。
    [77] 如請求項67至75中任一項之方法，其中該脂肪酸衍生物係藉由如請求項49至66中任一項之方法製備。
    [78] 一種製備如請求項1之脂肪酸衍生物之方法，其包括：a)酯化脂肪酸上之羧基以在該脂肪酸上產生酯；及b)偶合包含活性順丁烯二醯亞胺基之水溶性連接子與游離巰基(SH)，由此形成穩定的硫醚鍵；其中該脂肪酸衍生物可溶於水。
    [79] 一種製備如請求項1之脂肪酸衍生物之方法，其包括：a)酯化脂肪酸上之羧基以產生脂肪酸酯；b)使由步驟a)產生之該脂肪酸與疊氮試劑反應，由此產生相應脂肪酸疊氮化物；c)氫化步驟b)之該脂肪酸疊氮化物以產生相應脂肪酸胺；及d)偶合包含活性NHS基團之水溶性連接子與游離胺基，由此形成穩定的鍵；其中該脂肪酸衍生物可溶於水。
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    公开号 | 公开日
    EA032056B1|2019-04-30|
    BR112013015898A2|2018-06-26|
    ES2800983T3|2021-01-07|
    PL2654794T3|2020-07-27|
    NZ612320A|2015-06-26|
    EA201390940A1|2014-04-30|
    AU2011349574B9|2017-06-15|
    JP2014501262A|2014-01-20|
    MX2013007369A|2013-09-26|
    EP3673921A1|2020-07-01|
    US20120190096A1|2012-07-26|
    TWI546279B|2016-08-21|
    MX345608B|2017-02-07|
    KR20130129254A|2013-11-27|
    WO2012087838A1|2012-06-28|
    EP2654794B8|2020-04-22|
    CA2822591C|2020-12-29|
    AU2017204019A1|2017-07-06|
    AU2011349574A1|2013-07-11|
    CN103269723A|2013-08-28|
    EP2654794B1|2020-03-04|
    CA2822591A1|2012-06-28|
    AR084576A1|2013-05-29|
    SG191298A1|2013-07-31|
    AU2011349574B2|2017-06-01|
    HUE049352T2|2020-09-28|
    JP6138052B2|2017-05-31|
    PT2654794T|2020-06-11|
    US8945897B2|2015-02-03|
    CN103269723B|2017-04-05|
    DK2654794T3|2020-06-08|
    KR102025442B1|2019-09-25|
    EP2654794A1|2013-10-30|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    US4179337A|1973-07-20|1979-12-18|Davis Frank F|Non-immunogenic polypeptides|
    JPS6261600B2|1978-02-24|1987-12-22|Sanyo Chemical Ind Ltd||
    US4356170A|1981-05-27|1982-10-26|Canadian Patents & Development Ltd.|Immunogenic polysaccharide-protein conjugates|
    US4757006A|1983-10-28|1988-07-12|Genetics Institute, Inc.|Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production|
    US4970300A|1985-02-01|1990-11-13|New York University|Modified factor VIII|
    US5250421A|1986-01-03|1993-10-05|Genetics Institute, Inc.|Method for producing factor VIII:C-type proteins|
    US5198349A|1986-01-03|1993-03-30|Genetics Institute, Inc.|Method for producing factor VIII:C and analogs|
    JPH0387173A|1987-09-10|1991-04-11|Teijin Ltd|Preparation of human active natural type factor viii c and transformant using the same|
    US5153265A|1988-01-20|1992-10-06|Cetus Corporation|Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1|
    US4966999A|1988-06-07|1990-10-30|Cytogen Corporation|Radiohalogenated compounds for site specific labeling|
    US5122614A|1989-04-19|1992-06-16|Enzon, Inc.|Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides|
    SE465222C5|1989-12-15|1998-02-10|Pharmacia & Upjohn Ab|Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning|
    SE466754B|1990-09-13|1992-03-30|Berol Nobel Ab|Saett att kovalent binda biopolymerer till hydrofila ytor|
    US5492821A|1990-11-14|1996-02-20|Cargill, Inc.|Stabilized polyacrylic saccharide protein conjugates|
    CA2101918A1|1991-03-18|1992-09-19|Samuel Zalipsky|Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers|
    US5846951A|1991-06-06|1998-12-08|The School Of Pharmacy, University Of London|Pharmaceutical compositions|
    US6037452A|1992-04-10|2000-03-14|Alpha Therapeutic Corporation|Poly-Factor VIII or Factor IX conjugate|
    AU5098193A|1992-09-01|1994-03-29|Berlex Laboratories, Inc.|Glycolation of glycosylated macromolecules|
    WO1994007510A1|1992-10-02|1994-04-14|Kabi Pharmacia Ab|Composition comprising coagulation factor viii formulation, process for its preparation and use of a surfactant as stabilizer|
    NZ250375A|1992-12-09|1995-07-26|Ortho Pharma Corp|Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives|
    US5298643A|1992-12-22|1994-03-29|Enzon, Inc.|Aryl imidate activated polyalkylene oxides|
    WO1994015625A1|1993-01-15|1994-07-21|Enzon, Inc.|Factor viii - polymeric conjugates|
    US5621039A|1993-06-08|1997-04-15|Hallahan; Terrence W.|Factor IX- polymeric conjugates|
    SE504074C2|1993-07-05|1996-11-04|Pharmacia Ab|Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering|
    US6869930B1|1993-09-17|2005-03-22|Novo Nordisk A/S|Acylated insulin|
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    US6011007A|1993-09-17|2000-01-04|Novo Nordisk A/S|Acylated insulin|
    EP0788375A3|1994-11-09|1997-09-17|Offord Robin Ewart||
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    WO1996040662A2|1995-06-07|1996-12-19|Cellpro, Incorporated|Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates|
    SE9503380D0|1995-09-29|1995-09-29|Pharmacia Ab|Protein derivatives|
    US5866538A|1996-06-20|1999-02-02|Novo Nordisk A/S|Insulin preparations containing NaCl|
    JP2002505574A|1997-04-30|2002-02-19|エンゾン，インコーポレイテッド|ポリアルキレンオキシド修飾された単鎖ポリペプチド|
    US6183738B1|1997-05-12|2001-02-06|Phoenix Pharamacologics, Inc.|Modified arginine deiminase|
    NZ500633A|1997-06-04|2002-10-25|Oxford Biomedica Ltd|Vector|
    WO1999003496A1|1997-07-21|1999-01-28|The University Of North Carolina At Chapel Hill|Factor ix antihemophilic factor with increased clotting activity|
    EP1036179B2|1997-12-03|2014-01-01|Roche Diagnostics GmbH|Verfahren zur herstellung von polypeptiden mit geeigneter glykosilierung|
    US5985263A|1997-12-19|1999-11-16|Enzon, Inc.|Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates|
    US6596398B1|1998-08-21|2003-07-22|Atofina Chemicals, Inc.|Solar control coated glass|
    US6552167B1|1998-08-28|2003-04-22|Gryphon Therapeutics, Inc.|Polyamide chains of precise length|
    ES2630278T3|1998-10-16|2017-08-21|Biogen Ma Inc.|Conjugados poliméricos de interferón beta-1a y usos de los mismos|
    DE19852729A1|1998-11-16|2000-05-18|Werner Reutter|Rekombinante Glycoproteine, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Arzneimittel und ihre Verwendung|
    EP1820516B1|1999-02-22|2013-07-24|University of Connecticut|Novel albumin-free factor VIII formulations|
    CN1358171A|1999-06-08|2002-07-10|拉卓拉药物公司|包含氨基氧基的化合价平台分子|
    US6531122B1|1999-08-27|2003-03-11|Maxygen Aps|Interferon-β variants and conjugates|
    US7230081B1|1999-11-12|2007-06-12|Maxygen Holdings, Ltd.|Interferon gamma conjugates|
    US7074878B1|1999-12-10|2006-07-11|Harris J Milton|Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom|
    US6413507B1|1999-12-23|2002-07-02|Shearwater Corporation|Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly |
    AU783512B2|2000-02-11|2005-11-03|Bayer Healthcare Llc|Factor VII or VIIa-like molecules|
    AT485371T|2000-05-03|2010-11-15|Novo Nordisk Healthcare Ag|Varianten des menschlichen koagulationsfaktors vii|
    EP1280548B1|2000-05-03|2013-12-11|Novo Nordisk Health Care AG|Subcutaneous administration of coagulation factor VII|
    EP1292337A2|2000-06-08|2003-03-19|La Jolla Pharmaceutical|Multivalent platform molecules comprising high molecular weight polyethylene oxide|
    US6423826B1|2000-06-30|2002-07-23|Regents Of The University Of Minnesota|High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides|
    US7118737B2|2000-09-08|2006-10-10|Amylin Pharmaceuticals, Inc.|Polymer-modified synthetic proteins|
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    GB0103877D0|2001-02-16|2001-04-04|King S College London|Novel Drug Delivery system|
    HU0401124A3|2001-03-22|2006-01-30|Novo Nordisk Healthcare Ag|Coagulation factor vii derivatives|
    US6913915B2|2001-08-02|2005-07-05|Phoenix Pharmacologics, Inc.|PEG-modified uricase|
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    ES2556338T3|2001-10-10|2016-01-15|Novo Nordisk A/S|Remodelación y glicoconjugación de péptidos|
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    US7122189B2|2002-08-13|2006-10-17|Enzon, Inc.|Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers|
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    EP1578841B2|2002-12-31|2016-10-12|Nektar Therapeutics AL, Corporation|Maleamic acid polymer derivatives and their bioconjugates|
    DE60329627D1|2002-12-31|2009-11-19|Nektar Therapeutics Al Corp|Hydrolysestabile maleimidendgruppen-enthaltende polymere|
    EP2572732A1|2003-02-26|2013-03-27|Nektar Therapeutics|Polymer-factor VIII moiety conjugates|
    US7623892B2|2003-04-02|2009-11-24|Palm, Inc.|System and method for enabling a person to switch use of computing devices|
    ES2512499T3|2003-04-08|2014-10-24|Yeda Research And Development Co., Ltd.|Fármacos pegilados reversibles|
    US7087229B2|2003-05-30|2006-08-08|Enzon Pharmaceuticals, Inc.|Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers|
    EP1654004A2|2003-08-08|2006-05-10|Novo Nordisk A/S|Synthesis and application of new structural well defined branched polymers as conjugating agents for peptides|
    RU2333223C2|2003-08-12|2008-09-10|Лайпоксен Текнолоджиз Лимитед|Альдегидные производные сиаловой кислоты, способы их получения, конъюгаты альдегидных производных сиаловой кислоты и фармацевтическая композиция на их основе|
    WO2006016168A2|2004-08-12|2006-02-16|Lipoxen Technologies Limited|Sialic acid derivatives|
    US8633157B2|2003-11-24|2014-01-21|Novo Nordisk A/S|Glycopegylated erythropoietin|
    NZ546733A|2003-12-03|2009-07-31|Novo Nordisk As|Glycopegylated factor IX|
    US20060040856A1|2003-12-03|2006-02-23|Neose Technologies, Inc.|Glycopegylated factor IX|
    BRPI0417342A|2003-12-03|2007-04-17|Neose Technologies Inc|fator estimulante de colÈnia de granulócitos glicopeguilado|
    US8361961B2|2004-01-08|2013-01-29|Biogenerix Ag|O-linked glycosylation of peptides|
    TW200603818A|2004-03-11|2006-02-01|Fresenius Kabi De Gmbh|Conjugates of hydroxyethyl starch and erythropoietin|
    GB0412181D0|2004-06-01|2004-06-30|Celltech R&D Ltd|Biological products|
    WO2006020372A2|2004-07-23|2006-02-23|Neose Technologies, Inc.|Enzymatic modification of glycopeptides|
    JP2008507990A|2004-08-02|2008-03-21|ノボノルディスクヘルスケアアクチェンゲゼルシャフト|Ｆｖｉｉの抱合体|
    EP1799249A2|2004-09-10|2007-06-27|Neose Technologies, Inc.|Glycopegylated interferon alpha|
    MX350293B|2004-11-12|2017-09-04|Bayer Healthcare Llc|Modificacion dirigida al sitio del factor viii.|
    CA2590590C|2004-12-22|2016-04-19|Ambrx, Inc.|Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides|
    JP5022231B2|2004-12-27|2012-09-12|バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド|ポリマー−フォンビルブラント因子結合体|
    WO2006074279A1|2005-01-06|2006-07-13|Neose Technologies, Inc.|Glycoconjugation using saccharyl fragments|
    KR20080013850A|2005-02-08|2008-02-13|더 카운실 오브 더 퀸즐랜드 인스티튜트 오브 메디컬 리서치|면역원성 분자|
    EP1891231A4|2005-05-25|2011-06-22|Novo Nordisk As|GLYCOPEGYLATED FACTOR IX|
    CN101242858B|2005-06-16|2012-12-19|尼克塔治疗公司|具有可降解键的轭合物以及用于制备这种轭合物的聚合物试剂|
    EP2360170A3|2005-06-17|2012-03-28|Novo Nordisk Health Care AG|Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprinsing at least one non-native cysteine|
    EP1919498A2|2005-08-26|2008-05-14|Maxygen Holdings Ltd.|Liquid factor vii composition|
    RU2008105545A|2005-08-30|2009-10-10|Ново Нордиск Хелс Кеа Аг |Жидкие препараты пэгилированного гормона роста|
    CA2634131C|2005-12-21|2014-02-11|Wyeth|Protein formulations with reduced viscosity and uses thereof|
    AU2007215566A1|2006-01-19|2007-08-23|Ambrx, Inc.|Non-natural amino acid polypeptides having modulated immunogenicity|
    US7645860B2|2006-03-31|2010-01-12|Baxter Healthcare S.A.|Factor VIII polymer conjugates|
    CA2647314A1|2006-03-31|2007-11-08|Baxter International Inc.|Pegylated factor viii|
    WO2007140282A1|2006-05-24|2007-12-06|Peg Biosciences|Peg linker compounds and biologically active conjugates thereof|
    US7939632B2|2006-06-14|2011-05-10|Csl Behring Gmbh|Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity|
    SI2049692T1|2006-07-13|2016-04-29|Serum Institute Of India Ltd|Postopek za pripravo polisialične kisline visoke čistosti|
    ES2531934T3|2006-09-01|2015-03-20|Novo Nordisk Health Care Ag|Glicoproteínas modificadas|
    EP2054521A4|2006-10-03|2012-12-19|Novo Nordisk As|METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES|
    JP2010510180A|2006-11-17|2010-04-02|ニーア・ハムレット・ファルマ・アー・ベー|α−ラクトアルブミン組成物|
    PT2101821E|2006-12-15|2014-10-03|Baxter Int|Fator conjugado viia-ácido siálico com prolongamento do tempo de meia vida in vivo|
    CA2671851A1|2006-12-28|2008-07-10|Ambrx, Inc.|Phenazine and quinoxaline substituted amino acids and polypeptides|
    US20100143326A1|2007-01-03|2010-06-10|Novo Nordisk Healthcare A/G|SUBCUTANEOUS ADMINISTRATION OF COAGULATION FACTOR VIIa-RELATED POLYPEPTIDES|
    WO2008119815A1|2007-04-02|2008-10-09|Novo Nordisk A/S|Subcutaneous administration of coagulation factor ix|
    CA2690554C|2007-06-26|2016-08-16|Baxter International Inc.|Hydrolysable polymeric fmoc - linker|
    US9333247B2|2007-07-03|2016-05-10|Children's Hospital & Research Center At Oakland|Oligosialic acid derivatives, methods of manufacture, and immunological uses|
    US20100239517A1|2007-10-09|2010-09-23|Stephen Brocchini|Novel conjugated proteins and peptides|
    EP2070951A1|2007-12-14|2009-06-17|Fresenius Kabi Deutschland GmbH|Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers|
    WO2009089396A2|2008-01-08|2009-07-16|Neose Technologies, Inc.|Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases|
    DK2257311T3|2008-02-27|2014-06-30|Novo Nordisk As|Konjugerede Faktor VIII-Molekyler|
    ES2466340T3|2008-04-24|2014-06-10|Cantab Biopharmaceuticals Patents Limited|Conjugados de Factor IX con semividas extendidas|
    JP2011520999A|2008-05-23|2011-07-21|ノボノルディスクヘルスケアアーゲー|高濃度の芳香族保存料を有するペグ官能化セリンプロテアーゼの製剤|
    JP5642065B2|2008-05-23|2014-12-17|ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー|ペグ化されたｇｌａ−ドメイン含有タンパク質を含む低粘度組成物|
    CN102112623A|2008-06-04|2011-06-29|拜耳医药保健有限公司|用于治疗血管性血友病的fviii突变蛋白|
    WO2010010324A1|2008-07-21|2010-01-28|Polytherics Limited|Novel reagents and method for conjugating biological molecules|
    WO2010062768A1|2008-11-03|2010-06-03|Bayer Healthcare Llc|Method for the treatment of hemophilia|
    WO2010083536A1|2009-01-19|2010-07-22|Bayer Healthcare Llc|Protein conjugate having an endopeptidase-cleavable bioprotective moiety|
    ES2401965T3|2009-02-19|2013-04-25|Novo Nordisk A/S|Modificación de Factor VIII|
    EP2403538B1|2009-03-04|2017-10-04|Polytherics Limited|Conjugated proteins and peptides|
    WO2010120365A2|2009-04-16|2010-10-21|Wu Nian|Protein-carrier conjugates|
    WO2010140148A1|2009-06-01|2010-12-09|Yeda Research And Development Co . Ltd|Prodrugs containing albumin binding probe|
    US20120164130A1|2009-07-31|2012-06-28|Bayer Healthcare Llc|Modified Factor IX Polypeptides and Uses Thereof|
    DE102009028526A1|2009-08-13|2011-02-24|Leibniz-Institut Für Polymerforschung Dresden E.V.|Verfahren zur Modifikation und Funktionalisierung von Sacchariden|
    WO2011037896A2|2009-09-25|2011-03-31|Vybion, Inc.|Polypeptide modification|
    WO2011064247A1|2009-11-24|2011-06-03|Novo Nordisk Health Care Ag|Method of purifying pegylated proteins|
    WO2011101277A1|2010-02-16|2011-08-25|Novo Nordisk A/S|Conjugated proteins|
    EP2536753B1|2010-02-16|2017-12-20|Novo Nordisk A/S|Factor viii molecules with reduced vwf binding|
    GB201007356D0|2010-04-30|2010-06-16|Leverton Licence Holdings Ltd|Conjugated factor VIIa|
    GB201007357D0|2010-04-30|2010-06-16|Leverton Licence Holdings Ltd|Conjugated factor VIII|
    DK2598172T3|2010-07-30|2019-07-01|Baxalta GmbH|Nukleofile katalysatorer til oximforbindelse|
    EP2640483A1|2010-11-15|2013-09-25|Biogen Idec Inc.|Enrichment and concentration of select product isoforms by overloaded bind and elute chromatography|
    CN103796670A|2011-07-08|2014-05-14|比奥根艾迪克依蒙菲利亚公司|因子viii嵌合和杂合多肽及其使用方法|JP2015535304A|2012-09-10|2015-12-10|ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ|固相グリカンおよび糖ペプチド分析、ならびにグライコミクス抽出用マイクロ流体チップ、これを使用するための分析および方法|
    CN103897031A|2012-12-25|2014-07-02|深圳先进技术研究院|化学修饰的胸腺五肽及其合成方法|
    US20140243220A1|2013-02-25|2014-08-28|J. Craig Venter Institute|Metaproteomic Method to Identify Secreted Pattern Recognition Molecules and Adhesive Antimicrobial Factors for Detection of Microbial Agents Eliciting Inflammation in the Human Host|
    US20160311933A1|2013-03-20|2016-10-27|Fresenius Kabi Deutschland Gmbh|Process for the preparation of thiol functionalized hydroxyalkyl starch derivatives|
    CN103636918B|2013-12-13|2015-11-04|东北农业大学|一种富含亚油酸的改性分离蛋白制备方法|
    WO2015095553A1|2013-12-20|2015-06-25|Nephrogenesis, Llc|Methods and apparatus for kidney dialysis|
    EP2915569A1|2014-03-03|2015-09-09|Cytune Pharma|IL-15/IL-15Ralpha based conjugates purification method|
    CN107921103A|2015-08-12|2018-04-17|细胞机械股份有限公司|涉及长半衰期凝血复合物的方法和组合物|
    CN106554425B|2015-09-18|2018-10-30|沈阳药科大学|一种聚唾液酸的脂质接枝衍生物及其应用|
    WO2017095201A1|2015-12-02|2017-06-08|한미약품 주식회사|지방산 유도체를 이용한 단백질 결합체 및 이의 제조방법|
    CN108147990A|2016-12-02|2018-06-12|上海中医药大学|一种膜锚定元件及其应用|
    CA3052639A1|2017-02-08|2018-08-16|Bristol-Myers Squibb Company|Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof|
    CN107141354A|2017-05-05|2017-09-08|李斯文|一种融合蛋白及光敏剂复合物及其制备方法和应用|
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    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    US201061426356P| true| 2010-12-22|2010-12-22||
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